3D培养及原位癌对乳腺癌及大肠癌细胞基因组甲基化及表观可塑性的影响

发布时间：2020-04-06 19:56

【摘要】：“表观可塑性”指的是细胞通过染色质重塑改变基因表达谱,达到改变分化状态的能力。表观可塑性在胚胎干细胞(ESC)及组织多能干细胞中表现的最为明显,一般发生于胚胎发育过程中,并受微环境诱导。最近越来越多的研究显示,在肿瘤细胞中,也存在表观可塑性,在外界环境的刺激下,这些细胞可以进行重编程(reprogramming),表型发生转变。~([1-4])一些高度恶性的肿瘤细胞可以表现出很强的表观可塑性,可以适应不同的微环境,获得耐药能力、侵袭转移能力、免疫逃逸能力的改变。~([5])表观遗传调控体系-DNA甲基化、组蛋白乙酰化、核小体定位、miRNA表达等在表观可塑性的形成中发挥了重要作用。~([6])在结肠癌和乳腺癌中发现了很多受双向表观遗传学控制的基因,其中一部分为抑癌基因,启动子区发生高甲基化,是肿瘤发生的重要驱动因素,而另外一部分与肿瘤细胞的代谢、耐药、侵袭和转移相关,并表现出对微环境反应的表观可塑性。~([7-10])目前的研究大部分基于2D培养,2D培养缺乏必要的细胞微环境,肿瘤细胞本身可能已经发生了染色质重塑、表型改变~([2])。有统计显示,体外实验显示有效的药物,仅有5%在体内显现出抗肿瘤活性。而且2D培养细胞与3D培养细胞在增殖、侵袭、转移等生物行为方面皆有很大的差异~([4])。为了探明微环境诱导的基因组甲基化改变,及其对肿瘤细胞耐药、侵袭、转移等表观可塑性的影响,我们做了如下的研究:1.首先,采用Matrigel胶3D on-top的方法成功构建了人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人大肠腺癌细胞系DLD-13D培养模型,这二者在3D培养下都可以突破接触生长抑制,6-8日后皆可以形成直径大于100um的细胞球,MDA-MB-231 3D培养球呈Stellate形,细胞结合相对疏松,而DLD-1 3D培养细胞球呈Mass形,细胞之间结合紧密;2.采用皮下肿瘤组织块原位移植的方法成功构建乳腺癌和大肠癌的原位模型,术后约6-8周在免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪垫和结肠黏膜下,乳腺癌和大肠癌肿瘤组织皆可生长至直径接近1cm。对这两个细胞系形成的2D、3D、原位癌模型进行如下的检测,来探究肿瘤细胞微环境反应性表观可塑性;2.针对Ki-67进行免疫荧光染色,可见肿瘤细胞在3D培养下增殖速率要远小于2D模型;3.采用相对定量MSP(Q-MSP)检测乳腺癌和大肠癌中肿瘤发生相关基因甲基化水平变化,如BRCA1、CDH1、CDKN2A、PTEN、RASSF1、RUNX3、MLH、MGMT等,发现这些基因甲基化谱并未因微环境的改变而发生变化;采用RT-PCR的方法检测这些基因的mRNA水平,进一步验证了这些基因在2D、3D、原位癌中无转录水平差异;4.采用Illuminum Infinium Human Methylation 450K BeadChip芯片检测全基因组甲基化,GO分析和KEGG分析显示MDA-MB-231 3D、原位癌与2D培养之间主要的甲基化差异谱为多细胞组织形成相关基因,如HOXC4和HOXC5,而DLD-1 3D、原位癌与2D培养之间主要的甲基化差异谱为跨膜转运相关基因,如chloride channel、sodium channel、Potassium channel,GABA receptor,solute carrier family等。两个细胞系进行3D培养后差生的甲基化差异谱绝大多数不同,但是两个细胞系原位癌模型中甲基化差异谱有很多相同,如肿瘤发生相关基因、CDK2、CDK6、cyclin D1、Wnt(1、3、5、6、7、10、11)、BCL-2相关调往抑制因子、FGF、信号传导和转录激活因子、collagenⅣ、laminin等;5.采用Wstern Blot方法对比DLD-1 2D和3D培养细胞中N-cadherin和vimentin的表达水平,显示N-cadherin和vimentin表达增高,说明肿瘤EMT能力增强;6.通过流式细胞仪检测肿瘤干细胞比例,发现DLD-1 3D培养后,干细胞比例并无增高;但是RT-PCR显示SOX2 mRNA水平增长达百倍以上,说明肿瘤细胞仍然获得了更强的多能性;7.通过RT-PCR检测重要耐药基因的mRNA表达水平,发现bcl-2、top-1、ABCC1、ABCC2、ABCC6、MDR mRNA水平在在原位癌模型中明显增高,且通过甲基化芯片检测结果可见上述基因的甲基化状态在原位癌中也多数有改变。以上实验结果说明,第一:乳腺癌及大肠癌细胞在3D培养及形成原位癌后,与肿瘤发生相关的抑癌基因的甲基化状态并无改变;第二:乳腺癌和大肠癌细胞皆明显表现出针对微环境的表观可塑性,DNA甲基化在其中发挥了重要的调控作用,体现在如下几方面,1.不同的细胞系会根据自身生存需要采取相应的表型改变,MDA-MB-231 3D培养细胞中多细胞形成基因甲基化改变,利于松散联系的细胞形成肿瘤组织,DLD-1 3D培养细胞中跨膜通道相关基因甲基化改变,利于紧密连接的细胞之间进行离子及营养物质的输送;2.形成原位癌后,乳腺癌和大肠癌中的基因甲基化改变多达几千个,而且很多存在很多相同改变。首先肿瘤相关基因甲基化改变,使肿瘤获得更强的增殖和克隆演变能力。其次多个耐药基因的甲基化及mRNA水平改变,使肿瘤获得了更强的药物代谢能力及耐药性,再次,与EMT过程相关的cadherin和Vimentin等基因甲基化及表达水平在3D培养和原位癌中皆有明显变化,使肿瘤获得更强的转移能力。综上所述,我们的实验研究应尽可能基于3D或者原位癌模型,并努力完善3D培养模型,使之更接近于实际微环境;乳腺癌和大肠癌肿瘤细胞表现出强大的表观可塑性,基因甲基化是其中重要的调控机制,其中的某些关键途径,可能为协同抗肿瘤治疗提供靶点。
【图文】：

培养环境,橘黄色,整合素,胶原蛋白

3D 培养的细胞通过 β-整合素（橘黄色）与周围培养环境形sell 实验室初次证明了在漂浮的胶原蛋白凝胶之上培养的细胞基底膜，这些基底膜对分子对组织特异性结构和功能是至关细胞外基质的一种形态，富含胶原蛋白Ⅳ和组织特异性层粘上皮细胞下层，和上皮细胞及其他细胞近期直接接触。在体于沿基底膜的极性组织的形成。Laminin-111 是胚胎和乳腺腺要成分，往往在组织细胞基底部多聚化形成信号传导架构。使上述架构更稳定。（图 1.2）很多科学家希望能人工合成更接近每种细胞真实的细胞外环境。Plachot 等发现能使 S1管结构的是那些能胶化并且富含 laminin-111 的提取物。

基底膜,极性,多聚

图 1.2 基底膜结构的组成（a）laminin-111 (绿色)多聚化，并与细胞表面的 integrins（蓝色）多聚化的 laminin-111 不能形成超分子结构，不够稳固，所以培养细极性，所以紧密结合蛋白（粉色）不能再细胞的极性端形成紧密连接化 laminin-111 (绿色)被 type IV collagen（红色）锚链，其间经过巢蛋形成稳固的结构（黄色），此时 integrins（蓝色）可以形成极性分胞与之进行信息交互后，形成正确的极性腺管。虽然鸡胚胎基底层结构含有 collagen Ⅳ和 laminin-111，但是并不能基底膜或者细胞极性形成，因为其不能胶化。越来越多的证据表明密度同样会对细胞的生物学行为产生重要的影响。[17]近期的研究表的整合素受体及可变形的细胞骨架会感知培养模型的致密度，并相
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9;R735.34

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