基于双功能裂开型核酸适配体的肿瘤细胞检测研究

发布时间：2020-04-09 12:47

【摘要】：核酸适配体作为新兴的识别分子,具有高亲和力、高特异性、易合成修饰、设计灵活等优点,已经被广泛地应用于肿瘤诊断和治疗等领域。然而,核酸适配体往往存在序列较长、构型设计复杂、标记成本较高等缺点,因此,对其进行序列改造是非常有必要的。其中,通过对核酸适配体进行裂分获得的裂开型核酸适配体,巧妙地弥补了以上的缺点。此外,基于核酸适配体的light-up荧光探针为发展高信背比、高特异性和免标记的检测方法提供了新的契机。基于此,本论文以发展免标记、低成本和高灵敏的肿瘤细胞检测方法为目标,通过对核酸适配体序列进行裁剪、裂分和拼接,设计了一种双功能裂开型核酸适配体探针,以肿瘤细胞为研究对象,建立了两种检测方法。具体研究内容如下:一、双功能裂开型核酸适配体的构建及其肿瘤细胞免标记检测研究利用人肝癌细胞系SMMC-7721的特异性核酸适配体与激活硫黄素T(ThT)荧光的核酸适配体,通过裁剪、裂分和拼接等过程,设计了一种新的双功能裂开型核酸适配体探针(BFSA)。BFSA与ThT混合后形成BFSA/ThT复合探针,此时ThT的荧光被激活。该复合探针能够特异性结合靶细胞,通过洗涤去除多余探针,即可实现肿瘤细胞SMMC-7721的免标记和低成本检测。该探针在100μL结合缓冲液中最低检测到了125个细胞,且实现了对20%人血清样品中靶细胞的定量检测,此方法为肿瘤和医学诊断研究提供了一种新的思路。二、靶标介导组装的light-up荧光探针用于肿瘤细胞的一步式检测研究在上一个研究工作中,我们设计的BFSA虽然能够实现肿瘤细胞的免标记检测,但需要洗去未结合的探针来降低背景信号,使得操作较为复杂。如果将BFSA的一个片段与一条互补序列杂交,先封闭荧光染料的激活区域,设计成一种激活式的荧光探针,有望解决以上问题。鉴于此,我们建立了一种靶标介导组装的light-up荧光探针:在无靶标时,BFSA的两个片段相互独立,并且其与ThT结合的区域被封闭,因此荧光信号微弱;而当靶标存在时,则会诱导各片段的组装,BFSA激活ThT荧光的功能恢复,从而产生强烈的荧光信号,实现肿瘤细胞SMMC-7721的免洗的一步式检测。该探针在100μL结合缓冲液中可检测到125个细胞,且在20%人血清样品中具有良好的稳定性。此外,该探针具有良好的选择性,可明显区分靶细胞与对照细胞。本方法只需将核酸适配体、荧光报告分子与靶标混合便能产生可检测的荧光信号,实现了肿瘤细胞的免洗、免标记、低成本的一步式检测。三、自动化工作站辅助的人血管生长素核酸适配体的筛选研究在以上研究工作中,我们发现并非所有的核酸适配体都适合设计成裂开型探针,因此,筛选更多的核酸适配体对解决这一问题显然是有帮助的。然而,经典的筛选方法过程繁琐、费时费力,非常有必要利用仪器设备来提高操作的自动化程度。有鉴于此,我们将自动化工作站引入到SELEX技术的操作流程中,以血管生长素(ANG)为靶标进行核酸适配体的筛选。目前已将恒温孵育、磁分离、单链制备与纯化等操作集成在自动化工作站上完成。经过了12轮的筛选工作,一共选择了16条序列做进一步的表征。结果表明,Y8和Y18能够特异性结合ANG,解离常数分别为108.4 nM和177.1 nM。随后又对Y8和Y18进行了序列优化,发现将前后引物去掉后的Y8-1和Y18-1对ANG的结合能力并没有因此被削弱。有趣的是,我们还发现截短后Y8-1和Y18-1还具有增强Hemin催化过氧化氢分解的能力,甚至比已知的G-四聚体序列Dz-11更强。因此,我们筛选得到的两条核酸适配体不仅能够用于识别ANG,还有望被用来发展基于脱氧核酶活性的检测方法。
【图文】：

序列,适配体,核酸,二价

建成一种二价核酸适配体。如图 1.7A 所示，38-GC 是由三个双链茎部（stem1,2和 3）和两个环部（GAA 和 AAA）组成的三向连接结构，中心为靶标的结合区域，作者将 38-GC 裂成两对不同的片段，其中茎部 3 保持原结构，随后将两组裂开的片段连接在一起，形成一种新的裂开型二价核酸适配体 CBSA（短片段是 SF，长片段是 LF）。此外，Tan 等[59]利用 T4 DNA 连接酶将两条相同的核酸适配体连接形成一种环二价核酸适配体。如图 1.7B 所示，作者首先将特异性结合肿瘤细胞CCRF-CEM 的核酸适配体 Sgc8 的茎部分别延长部分碱基，通过碱基互补作用使绿色和红色序列杂交，然后加入 T4 DNA 连接酶封闭缺口，从而构建了一种环二价核酸适配体。活体荧光实验表明，相比于单价核酸适配体，，环二价核酸适配体能够在肿瘤中更加有效地积累和保留，这种策略促进了核酸适配体在活体水平上的应用。除了将两个或多个核酸适配体拼接在一起以外，还可以将裂开型核酸适配体的片段通过辅助序列拼接成激活式探针。如本课题组 Lei 等[60]将裂开型核酸适配体片段用一段连接序列拼接成一条序列，并标记荧光染料，随后与一条淬灭片段互补杂交，并将互补碱基对设计成 GC 配对以装载药物阿霉素（DOX），从而构建了一种新型的诊疗一体化的裂开型 Aptamer 探针（图 1.7C）。

适配体,荧光探针,核酸

硕士学位论文核酸适配体的 light-up 荧光探针具有操作方便、成本低等优点于其它成像技术（如荧光原位杂交、绿色荧光蛋白等），light-低，可免洗直接进行检测。核酸适配体可能稳定了小分子的平过非辐射衰变途径（如热、分子运动）消耗能量，从而使辐射、磷光）占主导地位，导致荧光增强[62]（图 1.8）。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3;R730.43

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