Dynasore对肺癌A549细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响及其机制

发布时间：2020-04-09 13:16

【摘要】：肺癌是全球癌症死亡的主要原因,其中大多数是非小细胞肺癌。顺铂是一种被广泛用作治疗肺癌的一线化疗药,其通过抑制细胞增殖,侵袭和转移起作用。然而,由于顺铂在治疗肿瘤的过程中常常会出现耐药现象,这降低了其疗效并限制了其临床应用,因此急需进一步探索更为有效的治疗药物。近年来研究发现肺癌的发生与线粒体融合和分裂的失调相关。发动蛋白相关蛋白1(Dynamin-related protein 1,Drp1)是线粒体分裂所必需的。抑制肺癌细胞中Drp1可以降低肺癌细胞的增殖,增加细胞的凋亡。Dynasore是一种小分子的非选择性GTPase活性抑制剂,无论在体内还是体外,均可以抑制dynamin 1,dynamin 2和Drp1的GTPase活性。然而,Dynasore对肺癌A549细胞凋亡,增殖,侵袭及转移的影响尚不明确。目的:本课题主要探究Dynasore对肺癌A549细胞增殖、凋亡和侵袭转移的影响及其机制,并同时检测顺铂及其联合Dynasore用药对肺癌A549的抗癌作用,旨在探索出更为有效的肺癌治疗策略。研究方法:首先利用蛋白印记技术检测肺癌细胞系A549、H1299、H460和LK2以及人支气管上皮样细胞HBE细胞中Drp1蛋白表达水平。根据结果筛选出重点检测细胞系为肺癌A549,然后将A549细胞随机分为四组,分别为:对照组(Control,3%DMSO),顺铂组(Cisplatin,30μM),Dynasore组(Dynasore,80μM)和Dynasore+顺铂组(Dynasore 80μM,Cisplatin 30μM)。各组细胞干预处理后,采用MTT法检测各组细胞活性;采用克隆形成实验检测各组增殖能力;采用荧光分光光度计参照JC-1试剂盒和活性氧(reactive oxygen species,ROS)试剂盒操作说明检测各组线粒体膜电位(mitochondrial membrane potentials,MMP)和ROS含量;采用721分光光度计参照三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP),丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)试剂盒操作说明检测ATP、MDA和GSH含量;采用基质胶侵袭实验检测各组细胞侵袭能力;采用划痕试验检测各组细胞转移能力;采用蛋白印记技术检测线粒体分裂蛋白Drp1、发动蛋白2(Dynamin 2)、增殖细胞核抗原(ProliferatingCell NuclearAntigen,PCNA)、细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)、细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平;采用免疫荧光标记技术检测线粒体分裂蛋白Drp1、Dynamin 2、PCNA和Cleaved Caspase-3表达水平。结果:1、与HBE细胞系比较,A549、H1299、H460和LK2细胞中的Drp1蛋白含量均明显升高(P0.05),A549细胞系中Drp1表达含量明显高于其它几种细胞系(P0.05),但是H1299、H460和LK2这三种细胞系中Drp1表达无明显差异。2、Dynasore抑制肺癌A549细胞中Drp1和dynamin 2的表达。蛋白印记实验结果如下:与Control组比较,Dynasore组中Drp1和Dynamin 2含量明显降低,顺铂组和Dynasore+顺铂组的Drp1和Dynamin 2含量明显升高(P0.05);与顺铂组比较,Dynasore组和Dynasore+顺铂组Drp1和Dynamin 2含量均明显降低(P0.05);与Dynasore组比较,Dynasore+顺铂组的Drp1和Dynamin 2含量明显升高(P0.05)。免疫荧光实验中,我们采用Drp1和Dynamin 2平均荧光强度来反映各组中Drp1和Dynamin 2蛋白表达水平。免疫荧光结果与上述蛋白印记结果相一致(P0.05)。3、Dynasore抑制肺癌A549细胞增殖水平。蛋白印记结果如下:与Control组比较,Dynasore组,顺铂组和Dynasore+顺铂组的PCNA表达水平明显降低(P0.05);与顺铂组比较,Dynasore组PCNA表达水平明显升高,而Dynasore+顺铂组的PCNA表达水平明显降低(P0.05);与Dynasore组比较,Dynasore+顺铂组的PCNA表达水平明显降低(P0.05)。免疫荧光实验中,我们采用PCNA蛋白平均荧光强度来反映各组中PCNA蛋白表达水平。研究发现免疫荧光结果与上述蛋白印记结果相一致(P0.05)。MTT实验和克隆形成实验结果:与Control组比较,Dynasore组,顺铂组和Dynasore+顺铂组的细胞活性和增殖能力均明显降低(P0.05);与顺铂组比较,Dynasore组细胞活性和增殖能力明显升高,而Dynasore+顺铂组的细胞活性和增殖能力明显降低(P0.05);与Dynasore组比较,Dynasore+顺铂组的细胞活性和增殖能力明显降低(P0.05)。这些结果与PCNA的蛋白检测结果相一致。4、Dynasore诱导肺癌A549细胞线粒体功能障碍。与Control组比较,Dynasore组,顺铂组和Dynasore+顺铂组的MMP、ATP和GSH明显降低,而ROS和MDA含量明显升高(P0.05);与顺铂组比较,Dynasore组MMP、ATP和GSH明显升高,ROS和MDA含量明显降低,而Dynasore+顺铂组的MMP、ATP和GSH明显降低,ROS和MDA含量明显升高(P0.05);与Dynasore组比较,Dynasore+顺铂组的MMP、ATP和GSH明显降低,ROS和MDA含量明显升高(P0.05)。5、Dynasore激活肺癌A549细胞线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。蛋白印记结果如下:与Control组比较,Dynasore组,顺铂组和Dynasore+顺铂组的线粒体内Cyt C和AIF含量明显降低,胞浆内Cyt C和细胞核内AIF含量以及Cleaved Caspase-3表达水平明显升高(P0.05);与顺铂组比较,Dynasore组线粒体内Cyt C和AIF含量明显升高,胞浆内Cyt C和细胞核内AIF含量以及Cleaved Caspase-3表达水平明显降低,而Dynasore+顺铂组的线粒体内Cyt C和AIF含量明显降低,胞浆内Cyt C和细胞核内AIF的含量以及Cleaved Caspase-3表达水平明显升高(P0.05);与Dynasore组比较,Dynasore+顺铂组的线粒体内Cyt C和AIF含量明显降低,胞浆内Cyt C和细胞核内AIF含量以及Cleaved Caspase-3表达水平明显升高(P0.05)。我们进一步采用免疫荧光技术,采用Cleaved Caspase-3阳性细胞数反映各组中Cleaved Caspase-3表达水平,检测结果发现各组中Cleaved Caspase-3阳性细胞数变化趋势与上述蛋白印记检测结果一致。6、Dynasore抑制肺癌A549细胞的侵袭和迁移。与Control组比较,Dynasore组,顺铂组和Dynasore+顺铂组的侵袭细胞数均明显减少,细胞转移能力均明显降低(P0.05);与顺铂组比较,Dynasore组侵袭细胞数明显增多,细胞转移能力明显增高,而Dynasore+顺铂组的侵袭细胞数明显减少,细胞转移能力明显降低(P0.05);与Dynasore组比较,Dynasore+顺铂组的侵袭细胞数明显减少,细胞转移能力明显降低(P0.05)。结论:Dynasore抑制肺癌A549细胞增殖,侵袭和转移,并且诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制线粒体分裂和细胞自噬有关;Dynasore可以增强顺铂对肺癌A549细胞的抗癌作用。
【图文】：

19图 3.2 Dynasore 抑制 A549 细胞中 Drp1 和 dynamin 2 的表达（n = 6）A：各组 A549 细胞中 Drp1 和 dynamin 2 经典蛋白印记条带。B-C：定量分析 Drp1 (B)和 dynamin2 (C)蛋白表达水平。β-actin 是胞浆蛋白的内参蛋白。D-F：各组 A549 细胞中 Drp1(D，绿色) 和dynamin 2 (F，红色)经典免疫荧光图片。细胞核用 DAPI 标记（蓝色）。比例尺=200 μm (Drp1)和 50 μm (dynamin 2). E-G：定量分析 Drp1 (E) 和 dynamin 2 (G)的平均荧光强度值。与 control

图3.3 Dynasore 体外抑制 A549细胞增殖能力（n = 6）A：各组 A549 细胞中 PCNA 经典蛋白印记条带。B：定量分析 PCNA 蛋白表达水平。β-actin是胞浆蛋白的内参蛋白。C：各组 A549 细胞中 PCNA(绿色)经典免疫荧光图片。细胞核用 DAPI标记（蓝色），比例尺=50 μm. D：定量分析 PCNA 的平均荧光强度值。E：各组 A549 细胞增殖能力。F-G：各组 A549 细胞集落形成经典图片（F）及定量分析结果（G）。与 control 组比较，aP < 0.05；与 cisplatin 组比较，bP < 0.05；与 Dynasore 组比较，cP < 0.05。3.4 Dynasore 诱导 A549 细胞线粒体功能障碍正常 MMP 的维持是线粒体氧化磷酸化和 ATP 产生所必需的[26]。线粒体 ROS在细胞凋亡中起关键作用[4]。MDA 和 GSH 被认为是细胞内氧化水平的经典指标[27]。与 Control 组比较，Dynasore 组，顺铂组和 Dynasore+顺铂组的 MMP、ATP 和 GSH明显降低，，而 ROS 和 MDA 含量明显升高（P<0.05）；与顺铂组比较，Dynasore 组MMP、ATP 和 GSH 明显升高，ROS 和 MDA 含量明显降低，而 Dynasore+顺铂组
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

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本文编号：2620802