PRSS1对胃癌MGC803细胞增殖的影响及机制研究

发布时间：2020-04-13 13:21

【摘要】：[目的]胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率与死亡率均居消化系统肿瘤第一位。课题组前期通过定量蛋白质组学技术,筛选得到胃癌相关蛋白质丝氨酸蛋白酶1(PRSS1),并证实其在胃癌组织中高表达。本研究观察PRSS1低表达对胃癌MGC803细胞增殖的影响,并探究其作用机制。[方法]1.运用免疫组织化学及及免疫细胞化学检测胃癌组织芯片及MGC803细胞中PAR-2蛋白表达情况;2.将pc DNA6.2?-GW/Em GFP-mi R-PRSS1荧光干扰质粒转染入MGC803细胞,建立PRSS1低表达MGC803细胞,采用MTT比色法和平皿克隆形成实验,观察PRSS1低表达对MGC803细胞增殖的影响;3.运用FSLLRY-NH2(PAR-2抑制剂)与SLIGKV-NH2(PAR-2激动剂)分别孵育未处理MGC803细胞及PRSS1低表达MGC803细胞,探究PAR-2活性改变对MGC803细胞增殖的影响;4.采用Western blot检测PRSS1与PAR-2表达改变后,MGC803细胞内ERK1/2磷酸化情况,分析ERK信号通路在MGC803细胞增殖中的作用。[结果]1.PAR-2蛋白主要表达于细胞膜和细胞浆,其在正常胃粘膜组织、高分化、中分化、低分化胃腺癌组织及淋巴结转移癌组织中的阳性表达率分别为22.03%、75.00%、89.66%、94.23%和94.34%。PAR-2在高分化、中分化、低分化胃腺癌及淋巴结转移癌组织中表达高于正常胃粘膜组织(P=0.0418)。胃癌组织中PAR-2表达与肿瘤TNM分期(P=0.0001)及淋巴结转移有关(P=0.0122)。PAR-2在MGC803细胞中表达高于永生化胃上皮GES-1细胞。2.MTT实验结果发现,PRSS1低表达与FSLLRY-NH2(PAR-2抑制剂)孵育后,MGC803细胞均出现增殖抑制现象(P0.05)。SLIGKV-NH2(PAR-2激动剂)孵育后,PRSS1低表达MGC803细胞增殖抑制现象完全恢复(P0.05)。3.克隆形成实验结果发现,PRSS1低表达与FSLLRY-NH2(PAR-2抑制剂)孵育后,MGC803细胞克隆形成能力均受抑制(P0.001)。SLIGKV-NH2(PAR-2激动剂)孵育后,PRSS1低表达MGC803细胞克隆形成能力完全恢复(P0.001)。4.PRSS1低表达及FSLLRY-NH2(PAR-2抑制剂)孵育后,MGC803细胞中ERK1/2磷酸化水平下降(P0.01),抑制ERK信号通路活化。SLIGKV-NH2(PAR-2激动剂)孵育后,PRSS1低表达MGC803细胞中磷酸化ERK1/2表达增加(P0.05)。[结论]1.PAR-2在胃癌组织高表达,其表达与肿瘤TNM分期及淋巴结转移有关。2.PRSS1低表达降低PAR-2活化,阻碍ERK信号通路激活,抑制胃癌MGC803细胞增殖。
【图文】：

图 3.1 免疫组织化学染色观察 PAR-2 在胃癌组织中的表达A：正常胃粘膜组织；B：高分化腺癌组织；C：中分化腺癌组织；D：低分化腺癌组织；E：淋巴结转移癌组织。A-E：4×放大；A1-E1：10×放大；A2-E2：40×放大。表 3.1 PAR-2 在胃癌组织中的表达统计组织类型 例数（n）免疫组化结果（n）PAR-2 阳性率（%）阴性（-）弱阳性（+）中度阳性（++）强阳性（+++）正常胃粘膜组织59 46 6 5 2 22.03高分化腺癌组织8 2 1 3 2 75.00*中分化腺癌组织29 3 4 5 17 89.66*

为进一步验证 Western blot 结果，，采用免疫细胞化学染色，检测 MGC803 细胞中PAR-2 蛋白表达情况，并以永生化胃上皮 GES-1 细胞作对照。结果显示，MGC803 细胞膜与细胞浆中存在PAR-2表达，而GES-1细胞内未见表达（见图3.3）。结果与Westernblot 结果基本一致。图 3.3 免疫细胞化学染色观察 PAR-2 在 MGC803 及 GES-1 细胞中的表达A：MGC803 细胞；B：GES-1 细胞。A-B：10×放大；A1-B1：40×放大。3.2 建立 PRSS1 低表达 MGC803 细胞3.2.1 pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR-PRSS1 干扰载体的测序鉴定将 pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR-PRSS1 荧光干扰质粒及阴性对照质粒转化入感受态 JM109 大肠杆菌，氨苄青霉素筛选，扩增后抽提质粒，送上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序（见图 3.4A、B）。测序结果经 BLAST 分析，确认干扰质粒中包含完整 PRSS1 干扰序列（见图 3.4 C），可用于后续实验。A A1B B1
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

【参考文献】

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本文编号：2626045