基于Warburg效应和阴阳气血失调研究LDH-A对肠型胃癌转移的影响和机制

发布时间：2020-04-13 16:30

【摘要】：1965年Lauren在胃癌的组织细胞学特点的基础上,将胃癌分成两种类型:肠型和弥漫型。两种类型的胃癌在大体形态、病理类型、来源、分化程度和细胞形态等方面均有不同。肠型胃癌大体形态为蕈伞型,病理类型包括乳头状和管状腺癌,此类型胃癌起源于肠上皮化生,癌细胞为分化程度较好、游离缘常可见刷状缘的柱状或立方形,类似于肠上皮的吸收细胞,部分细胞则类似于肠化生的杯状细胞,有腺腔形成,癌旁黏膜常伴有广泛的肠上皮化生和萎缩性胃炎。而弥漫型胃癌大体形态为溃疡型和弥漫浸润型,病理类型包括未分化癌和黏液癌,此类型胃癌起源于胃固有膜,癌细胞为分化程度较差、散在弥漫的小圆形细胞,无腺腔形成,癌旁黏膜无或仅有小片肠上皮化生和萎缩性胃炎。肠型胃癌和弥漫型胃癌发病原理和转移机制各不相同。阐明各自发生发展的具体分子途径对精准治疗、控制病情和提高预后具有重要意义。上皮间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),即失去上皮标记物E-cadherin,同时获得间质标记物N-cadherin、Fironectin和Vimentin表达。EMT在多种肿瘤的转移中发挥作用。能量代谢的重排是肿瘤的第七标记,肿瘤细胞最具特征的表型是Warburg效应,即肿瘤细胞即使在氧丰富情况下通过糖酵解而不是氧化磷酸化获得能量。丙酮酸脱氢酶激酶(Pyruvate dehydrogenase kinase 1,PDK1)是丙酮酸脱氢酶抑制剂,通过增强丙酮酸转化为乳酸促进乳腺癌肝转移[1]。因为充分利用Warburg效应降低肿瘤微环境乳酸对抑制肿瘤发展很重要,阐明乳酸上下游信号通路的驱动基因对精确治疗是十分必要的。乳酸脱氢酶A(Lactate dehydrogenase A,LDH-A)是催化丙酮酸转化为乳酸的限速酶。Sonveaux发现乳酸是无氧酵解和氧合肿瘤细胞能量代谢共生关系的纽带,抑制乳酸生成可以选择性杀死以乳酸提供能量的乏氧肿瘤细胞[2]。鉴于低氧是重要的胃癌EMT诱导因子[3-7],我们预测在恶性肿瘤中沉默LDH-A可以下调EMT,并通过检测EMT相关因子Snail、ZEB1、ZEB2、Vimentin、N-cadherin和E-cadherin的表达筛选出变化最显著的因子。第一部分LDH-A通过上调ZEB2促进肠型胃癌肿瘤转移目的:体外研究LDH-A是否促进肠型胃癌肿瘤转移及其发生机制。方法:A.采用Westernblot方法从人肠型胃癌细胞株MKN28、SGC7901、BGC823和人永生化胃粘膜上皮细胞株GES中筛选出LDH-A表达较高的两个细胞株。B.LDH-A干扰序列siRNA376、siRNA506和siRNA980分别瞬时转染经上步骤筛选的两个细胞株,Westernblot方法分别筛选出对LDH-A干扰效果最佳者。C.筛选出来的干扰序列瞬时转染LDH-A高表达的两个细胞株,48小时提取RNA,检测EMT标记物的表达变化。D.Wsternblot方法检测经Real-time RT-PCR方法筛选出的mRNA有显著变化的基因在蛋白水平的表达。E.侵袭和转移实验分别检测筛选出来的干扰序列瞬时转染LDH-A高表达的两个细胞株后侵袭和转移能力的变化。结果:A.与人永生化胃粘膜上皮细胞株GES相比,人肠型胃癌细胞株SGC7901和BGC823中LDH-A蛋白表达显著上调。B.Westernblot结果显示siRNA376在BGC823和SGC7901中抑制效果均最好,因此选择干扰序列siRNA376进行后续实验。C.siRNA376瞬时转染SGC7901细胞,Real-time RT-PCR结果显示LDH-A敲除显著下调间质标记物ZEB2和Vimentin(P0.001),而上皮标记物E-cadherin明显上调(P0.001),Snail、ZEB1 和 N-cadherin 表达无明显改变(P0.05)。Westernblot 结果证实在蛋白水平ZEB2和Vimentin的下调和E-cadherin的上调。D.siRNA376瞬时转染BGC823细胞,Real-time RT-PCR结果显示LDH-A敲除显著下调间质标记物 ZEB2、Vimentin(P0.001)和 Fibronectin(P0.01),而 E-cadherin 明显上调(P0.001)。Westemblot结果证实在蛋白水平ZEB2和Vimentin的下调和E-cadherin的上调。E.LDH-A敲除明显降低SGC7901和BGC823浸润和转移能力。结论:LDH-A通过上调ZEB2促进EMT而加速肠型胃癌细胞浸润和转移,提示LDH-A/ZEB2与肠型胃癌预后可能存在相关性。第二部分LDH-A/ZEB2和肠型胃癌预后相关性分析目的:通过免疫组化研究LDH-A表达与ZEB2、Vimentin表达和临床病理参数的相关性;通过单因素生存分析研究LDH-A和ZEB2联合表达与肠型胃癌预后的相关性。方法:371例肠型胃癌均有相对应的癌旁正常胃组织标本,并且均有完整的临床和5年随访资料,终末随访时间2010年3月。我们采用免疫组化方法检测LDH-A和ZEB2的表达,分别比较二者在肠型胃癌及其对应癌旁正常胃组织表达的差异,并研究LDH-A与临床病理资料的相关性,结合随访资料进一步进行生存分析。结果:A.免疫组化结果显示:与癌旁正常组织相比,LDH-A和ZEB2在肠型胃癌的高表达率显著升高(P0.001)。B.LDH-A在肠型胃癌中的高表达与ZEB2(P=0.003)、Vimentin(P=0.024)、浸润深度(P0.001)和区域淋巴结转移(P0.001)显著相关。而与其他临床病理参数如年龄、性别、肿瘤大小和分化程度无明显相关。C.单因素生存分析显示:LDH-A高表达患者5年总生存较LDH-A低表达患者降低(P0.001,log-rank检验)。ZEB2高表达患者5年总生存较ZEB2低表达患者降低(P0.001,log-rank检验)。LDH-A和ZEB2联合表达较单一表达预后差(P0.001,log-rank检验)。4.多因素分析显示:ZEB2高表达是总生存(P=0.003)独立的预后因素。结论:LDH-A表达与ZEB2表达呈正相关,LDH-A和ZEB2联合表达较单一表达预后差,LDH-A与ZEB2相关性为改善肠型胃癌预后提供治疗策略。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

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