顺铂对YAP介导的结肠癌生物学特性的影响及其机制研究

发布时间：2020-04-16 04:48

【摘要】：研究背景及意义结肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。结直肠癌的发病率及死亡率占恶性肿瘤第三位,且发病率呈上升趋势。多数病例发现结肠癌时已经是中晚期。虽然结肠癌的相关研究很多,但发病机制尚未完全明确。结肠癌的治疗,主要以手术为主,以及包括化疗、放疗、生物治疗等多种方法联合治疗,但效果往往仍不理想。结肠癌晚期常常发生血行及淋巴转移,术后复发及转移是死亡的常见原因。所以,进一步探讨结肠癌侵袭及转移的分子机制,对更加有效控制结肠癌细胞恶性增殖及远处转移,有较大价值。YAP(Yes associated protein),即Yes相关蛋白,是Hippo信号通路的主要效应分子。Hippo信号传导通路是调节器官大小和发育的关键通路,可通过促进细胞凋亡和抑制细胞增殖来调节细胞发育,从而控制细胞分裂和死亡。Hippo途径在多种形式的癌变中起着重要的和广泛的作用。YAP蛋白广泛表达于除外周血细胞外的各种组织中,能够与多种蛋白相互作用,参与细胞内多条信号通路的调控,并行使多种生物学功能。Hippo通路的异常激活可引起过度的细胞增殖,并减少细胞凋亡,导致肿瘤发生。多个研究证实,YAP高表达在多种人类癌症被观察到,例如非小细胞肺癌、胃癌、尿路上皮癌、食管鳞状细胞癌、卵巢癌、和宫颈癌等。顺铂(DDP)是经典的化疗药物,是第一个进入临床的金属基药物。DDP对多种肿瘤有治疗效果,抗癌谱广,疗效确切,但是它的作用机制尚未完全明确。本研究中,我们探讨DDP是否通过抑制YAP基因以抑制结肠癌进展。我们的数据.显示,在结肠癌中,Hippo/YAP信号途径异常活跃,促进增殖和侵袭。DDP治疗降低YAP表达,继而导致细胞周期阻滞,细胞凋亡和癌细胞衰老,除此之外,还能减少上皮间质转化和细胞体外侵袭、迁移。DDP还能增加E-钙粘蛋白的表达,降低波形蛋白的表达,并能调控YAP、磷酸化YAP在细胞核或细胞质之间的亚细胞分布。总之,我们的研究显示,DDP可以通过抑制YAP信号通路,起到抑制结肠癌进展的作用。而YAP的下调表达与DDP治疗显示了协同效应,该结果提示,DDP与YAP抑制剂联合应用,可能会取得较好的疗效。这为结肠癌的治疗开辟了新的思路。第一部分YAP在结肠癌中的表达以及对结肠癌细胞增殖、侵袭的影响目的:1.检测YAP在结肠癌组织和细胞中的表达情况。2.探讨YAP对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响。方法:选取2015年5月至2015年11月,在滨州医学院附属医院行手术治疗的46例结肠癌患者的癌组织和癌旁正常组织,同时收集患者的临床资料。应用选取的手术标本,以及SW620、LOVO结肠癌细胞,进行YAP的相关研究。1.RT-PCR检测YAP在结肠癌中的表达。2.Western blot检测YAP在结肠癌组织中的表达。3.Western blot检测YAP及其靶基因在结肠癌细胞中的表达。4.Western blot检测YAP在细胞核中的表达。5.SiRNA沉默YAP基因。6.YAP过表达载体转染结肠癌细胞。7.免疫荧光染色检测YAP和Ki67在SiYAP和过表达YAP细胞中的表达。8.克隆形成实验观察SiYAP和过表达YAP结肠癌细胞的克隆形成情况。9.细胞划痕实验观察SiYAP和过表达YAP结肠癌细胞的生长情况。10.Transwell迁移实验观察SiYAP和过表达YAP结肠癌细胞的迁移情况。11.Transwell侵袭实验观察SiYAP和过表达YAP结肠癌细胞的侵袭情况。12.统计分析:数据分析采用GraphPad Prism5软件,t检验用于两组之间的比较,方差分析和Tukey事后检验用于多组比较。生存分析应用Kaplan Meier法,绘制总生存期(OS)曲线。P0.05有统计学意义。结果:1.YAP在mRNA及蛋白水平,在结肠癌组织中的表达均明显增加。2.在结肠癌细胞中,YAP蛋白表达增加。3.YAP主要定位在细胞核,更多的存在于结肠癌细胞。而磷酸化YAP(p-YAP),为非活化形式,主要定位于细胞浆中,更多的存在于正常细胞中。4.YAP的靶基因Cyr61与CTGF在结肠癌细胞中表达增加。5.Kaplan Meier分析表明,YAP与生存期呈负相关。6.SiYAP的SW620细胞,YAP的mRNA和蛋白表达水平均降低。7.过表达YAP的SW620细胞,YAP的mRNA和蛋白表达水平增高。8.免疫荧光染色显示,YAP和Ki67在沉默YAP的SW620细胞中表达减少,而Ki67在过表达YAP的SW620细胞中表达增加。9.克隆形成实验显示,YAP过表达的细胞克隆形成增加,YAP基因沉默细胞克隆形成减少。10.细胞划痕实验表明,过表达YAP的SW620细胞迁移增加,而YAP沉默细胞迁移减弱。11.Transwell迁移实验及侵袭实验显示,过表达YAP的SW620细胞迁移侵袭能力均增强,而YAP沉默细胞迁移、侵袭能力均减弱。结论:1.YAP及其靶基因在结肠癌组织和细胞中表达增加。2.YAP可促进结肠癌的增殖、侵袭,YAP基因下调表达可抑制结肠癌的增殖和侵袭。第二部分顺铂通过YAP抑制结肠癌的恶性生物学特性及其机制探讨目的:1.检测顺铂是否通过YAP抑制结肠癌的增殖、侵袭和转移。2.研究顺铂通过YAP抑制结肠癌的恶性生物学特性的机制。方法:1.顺铂对YAP表达的影响及其机制研究1.1 RT-PCR检测不同浓度DDP对YAP表达的影响。1.2 Western blot检测不同浓度PPD对YAP表达的影响。1.3 RT-PCR检测DDP作用不同时间对YAP表达的影响。1.4 Western blot检测DDP不同治疗时间对YAP表达的影响。1.5荧光素酶试验检测DDP对YAP启动子区的作用。1.6 RT-PCR检测PPD对CYR61、CTGF表达的影响。1.7 Western blot检测DDP对CYR61及CTGF表达的影响。1.8细胞免疫荧光染色检测DDP对YAP、CYR61及CTGF表达的影响。1.9细胞免疫荧光染色检测DDP对YAP从细胞核向细胞质转运的影响。1.10 Western blot检测DDP对YAP在细胞核与细胞质表达的影响。2.顺铂通过YAP调控结肠癌细胞的增殖及机制研究2.1细胞增殖实验(CCK8)检测DDP对细胞增殖的影响。2.2 MTT实验检测DDP对细胞增殖的影响。2.3.细胞免疫荧光染色观察DDP对Ki67的影响。2.4克隆形成实验观察DDP对细胞克隆生成的影响。2.5流式细胞仪检测DDP对细胞周期的影响。3.顺铂通过YAP调控细胞凋亡的研究3.1流式细胞仪检测DDP对细胞凋亡的影响。3.2 Western blot 检测 DDP 对 caspase-3-cleaved 的表达的影响。3.3免疫荧光染色检测DDP对caspase-3-cleaved的表达的影响。4.顺铂通过YAP对结肠癌细胞衰老的影响5.顺铂对YAP介导的结肠癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响5.1.RT-PCR检测PPD对E-cadherin、Vimentin表达的影响。5.2.Western blot 检测PPD 对E-cadherin、Vimentin 表达的影响。5.3免疫荧光染色检测DDP对E-cadherin、Vimentin表达的影响。6.顺铂通过YAP抑制结肠癌肿瘤生长的研究6.1体内实验评估DDP对结肠癌移植瘤的作用。6.2苏木精-伊红(HE)染色和免疫组织化学染色检测DDP对YAP在肿瘤中表达的影响。6.3 HE染色检测DDP对小鼠各器官的影响。结果:1.顺铂对YAP的抑制作用及其机制。1.1经不同浓度和时间的DDP治疗,结肠癌细胞YAP的mRNA水平和蛋白水平均降低。1.2.DDP可抑制YAP基因启动子活性。1.3.DDP对YAP靶基因Cyr61和CTGF的抑制作用。1.4.DDP通过影响YAP的亚细胞定位以抑制YAP功能。2.顺铂通过YAP抑制结肠癌细胞的增殖。2.1.细胞增殖实验(CCK8)和MTT实验显示,过表达YAP导致细胞增殖增加,YAP沉默后细胞增殖受阻,DDP治疗后,阻断了 YAP介导的细胞增殖。2.2.免疫荧光显示,经DDP对SW620细胞治疗,Ki67降低。2.3.克隆形成实验显示,DDP可减少SW620细胞的细胞集落形成。2.4.细胞周期分析显示,经DDP治疗,诱导细胞周期阻滞在G2期,也阻断了 YAP诱导SW620细胞进入S期。3.顺铂通过YAP促进结肠癌细胞的凋亡。3.1流式细胞仪检测表明,经DDP治疗,SW620细胞凋亡明显增加。3.2 Western Blot分析显示,DDP治疗后,Caspase-3蛋白水平增加。3.3免疫荧光显示,DDP治疗后,Caspase-3蛋白水平增加。4.顺铂通过YAP促进结肠癌细胞的衰老。5.顺铂可降低YAP介导的结肠癌细胞的迁移和侵袭能力。5.1细胞划痕试验证实,经DDP治疗,结肠癌细胞迁移能力明显减弱。5.2 Transwell迁移实验证实,经DDP治疗,结肠癌细胞迁移能力明显减弱。5.3Transwell侵袭实验证实,经DDP治疗,结肠癌细胞侵袭能力明显减弱。6.顺铂通过YAP抑制结肠癌细胞的上皮间质转化(EMT)。7.顺铂通过YAP抑制结肠癌肿瘤的生长。结论:1.顺铂通过抑制YAP基因启动子活性、抑制YAP靶基因、影响YAP的亚细胞定位等机制,抑制YAP功能。2.顺铂通过YAP抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭和转移。3.顺铂通过YAP促进结肠癌细胞的凋亡和衰老。4.顺铂可抑制YAP介导的结肠癌细胞的上皮间质转化(EMT)。5.顺铂与siYAP对结肠癌有协同抑制作用,提示顺铂与YAP抑制剂可能会对结肠癌有协同治疗作用。
【图文】：

曲线,结肠癌组织

图１：结肠癌组织中ＹＡＰ异常激活。逡逑（Ａ）邋ＲＴ－ＰＣＲ检测表明，ＹＡＰ基因ｍＲＮＡ的表达增加。（Ｂ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌ析表明，，ＹＡＰ蛋白水平的表达也较癌旁正常组织增加。（Ｃ）邋ＹＡＰ表达采ａｐｌａｎ邋Ｍｅｉｅｒ总生存期（０Ｓ）曲线（采用显著性对数秩检验，ｎ＝邋１９２６，邋Ｐ＝邋ｌｅ－０９）（Ｄ）相对于正常ＮＣＭ４６０细胞，在ＬＯＶＯ和ＳＷ６２０结肠癌细胞ＹＡＰ蛋白平增加，同时核定位ＹＡＰ增加。（＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．００１）逡逑

结肠癌细胞,基因沉默,过表达

图２邋：邋ＹＡＰ基因沉默抑制结肠癌细胞的生长和侵袭。逡逑（Ａ）邋ＳＷ６２０邋细胞转染邋ＳｉＹＡＰ邋后，用邋ＲＴ－ＰＣＲ邋和邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋分析邋ｍＲＮＡ逡逑和蛋白表达水平。（Ｂ）在稳定过表达ＹＡＰ的ＳＷ６２０细胞，用ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ分析ｍＲＮＡ和蛋白表达水平。（Ｃ）在ＹＡＰ过表达ＳＷ６２０细胞，体外增逡逑殖增加，而在ＹＡＰ沉默细胞体外增殖减少。（Ｄ）免疫荧光染色显示，ＳｉＹＡＰ逡逑的ＳＷ６２０细胞，ＹＡＰ和Ｋｉ６７减少。（Ｅ）克隆形成实验显示，ＹＡＰ过表达的逡逑细胞克隆形成增加，ＹＡＰ沉默细胞，克隆形成减少。（Ｆ）划痕试验表明，过表逡逑达ＹＡＰ的ＳＷ６２０细胞迁移增加，而ＹＡＰ沉默细胞迁移减弱。（Ｇ）体外实验逡逑证明，ＹＡＰ过表达的ＳＷ６２０细胞侵袭和迁移增强，而基因沉默的ＹＡＰ侵袭和逡逑迁移降低。（＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．００１）逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.35

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