雄激素受体AR在肝细胞肝癌及其治疗过程中对自然杀伤细胞的影响及作用的研究

发布时间：2020-04-19 19:37

【摘要】：原发性肝细胞肝癌(HCC)是当前世界范围内发病率及致死率最高的恶性肿瘤之一,其糟糕的预后与缺乏有效治疗手段之间密不可分。近年来的研究表明,HCC中存在的性别差异现象与雄激素受体AR有着明显联系,而HCC中自然杀伤细胞(NK cells)又是肿瘤免疫监视中不可忽视的一个角色。研究目的:本篇研究旨在通过分子生物学的基础研究,深入阐明AR基因在HCC发生发展过程中对NK细胞的影响及作用,以及这些作用产生的分子机制。同时在针对HCC的药物治疗时,如何将AR基因作为指导治疗的一个重要因素,使得未来可以妥善将HCC药物治疗与NK细胞免疫治疗相结合。研究方法:我们基于乳酸脱氢酶细胞毒性实验(LDH cytotoxicity assay)对不同AR表达状态下或药物处理后的HCC细胞进行了 NK细胞杀伤实验,确定了何种条件时NK细胞对肿瘤的杀伤能力有所变化。随后利用RT-qPCR对NK细胞相关性分子基因进行了筛选,随后运用分子生物学技术,利用荧光素酶报告实验以及染色质沉淀实验,证明了 AR如何对NK细胞相关基因产生调控作用。另一方面,相关药物对AR产生的作用我们也使用microRNA相关试验及蛋白降解实验进行了研究。最后,所有的体外实验均通过临床标本及动物体内实验进行了验证。研究结果:实验结果证实,雄激素受体AR可以通过结合至IL-12A基因启动子特定区域,转录抑制IL-12A的表达,从而使得肿瘤微环境中IL-12表达量下降,抑制了 NK细胞对HCC细胞的免疫杀伤作用。同时,索拉菲尼可以通过降低AR表达量从而上调IL-12A表达,进而促进NK细胞对HCC细胞的杀伤功能。另一方面,我们发现顺铂可以通过抑制肝癌细胞中的AR从而解除AR对ULBP2的抑制,从而显著提高HCC肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性。而顺铂对AR产生的迅速而强效的抑制效果源自于两种途径,即顺铂诱导miR-34-5p从而下调AR,以及增强AR泛素化从而快速降解。这些数据同样也经过了临床标本及动物体内实验的证实。研究结论:AR作为引起肝细胞肝癌性别差异的决定性分子,可以通过多种途径干扰HCC中NK细胞对肿瘤的免疫监视及杀伤功能。而不同的化学药物治疗,在针对其靶向基因产生肿瘤抑制的同时,也可以经由对AR的作用从而产生意想不到的免疫促进作用,增强NK细胞对肿瘤的免疫活性。这些证据提示在未来的基于NK细胞的HCC免疫治疗中,AR或许可以成为一项提供诊疗依据并对病人进行分类的重要分子指标。
【图文】：

质粒,过表达,荧光素酶,肝癌细胞株

图２．５．１邋Ａ．邋ｐＷＰＩ过表达空载质粒；Ｂ．邋ｐＬＫＯ．ｌ敲减空载质粒；Ｃ．邋ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ荧光逡逑素酶报告质粒；Ｄ．ｐＲＬ－ＴＫ荧光素酶报告内参质粒；Ｅ．ＧＦＩＭＪｂ过表达质粒

示意图,流程,离心管,示意图

２５０沁Ｂｕｅｒ２，５，，（裂解时间不要超过５分钟）；逡逑加入３５０邋ｐｉ邋Ｂｕｆｆｅｒ邋Ｓ３，温和并上下颠倒５次混匀，室温１２０００ｒｐｍ离心１５邋ｍｉｎ；逡逑吸取上清液并转移到制备管（置于２ｍｌ离心管），室温１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，逡逑弃去滤过液；逡逑将制备管置回离心管，，加入５０0ｉａｌＢｕｆｆｅｒＷｌ，邋１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，弃滤液；逡逑将制备管置回离心管，加入７００｜ｉｌＢｕｆｆｅｒＷ２，１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，弃滤液；逡逑重复Ｗ２洗涤１－２次；逡逑将制备管置回２邋ｍｌ离心管中，室温１２０００ｒｐｍ离心１邋ｍｉｎ；逡逑将制备管放置入新的１．５邋ｍｌ离心管中，在中央网膜处加入８０｜ｉｌｄｄＨ２Ｏ，室温逡逑静置孵育５ｍｉｎ，离心收集滤过液，即为含质粒溶液；逡逑）使用ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００超微量分光光度计对获得的质粒溶液测定浓度及纯度，逡逑２６０／Ａ２８０在１．８０左右为宜，可在－２０°Ｃ下冻存长期保存。逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

【参考文献】