基于核酸适配体和等温扩增技术对人急性淋巴白血病细胞的高灵敏度检测

发布时间：2020-04-20 08:22

【摘要】：急性淋巴白血病是淋巴细胞在骨髓内异常增生引起的恶性肿瘤性疾病。其恶性肿瘤细胞不仅能够损害骨髓,抑制正常的造血功能,同时由于该肿瘤细胞易扩散也会损害到骨髓外的其他组织(如脑膜、淋巴结、肝等)。据报道,我国急性淋巴白血病的发病率为0.69/10万,其中青少年和儿童为高发病率群体,严重威胁人类的生命健康。因此,发展特异性高、灵敏度好的急性淋巴白血病检测方法,以实现其早期诊断来实施及时有效的治疗,对于减轻患者痛苦和提高治愈率具有重大意义。常见急性淋巴白血病早期诊断的方法有:免疫分析法、基因检测法、纳米检测法、光谱法等。这些方法由于检测的灵敏度较低、操作过程复杂、实验时间长等原因限制了其适用范围。核酸适配体(Aptamer),它是指某种人工合成的单链DNA或RNA分子,它们能够通过分子内作用力折叠成二级或三级结构从而对某种目标分子具有很强的特异结合的性能。由于核酸适配体不仅拥有抗体的主要性质,同时弥补了抗体的一些缺陷,而且还具有易合成、靶目标物丰富、修饰简单等优点,被研究者誉为“化学抗体”。此外,常被应用于高灵敏度检测核苷酸链的核酸等温扩增技术的应用已经比较成熟和完善,其可在某一特定温度下快速扩增出106-109倍(呈指数形式)目标核苷酸链。基于以上分析,本论文以发展新型的肿瘤细胞检测方法为目标,通过结合核酸适配体可用作新型肿瘤靶向识别分子的优点和核酸等温扩增技术能够高灵敏检测核苷酸链的性质,构建了一种新型检测急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM)的方法,并结合实时荧光定量手段对该肿瘤细胞进行了高灵敏、高特异性的检测研究。具体研究内容和主要结论如下:一、基于核酸适配体的环介导等温扩增(LAMP)法检测急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM)的研究在常规肿瘤细胞检测中,为了减小抗体受环境因素的影响,利用核酸适配体作为肿瘤细胞靶向识别分子,同时结合具有高灵敏的环介导等温扩增技术来实现对肿瘤细胞的高灵敏、高特异性的检测。在该项研究方案中,以CCRF-CEM细胞作为检测对象,选择其特异性的核酸适配体sgc8c作为捕获该细胞的识别分子,设计一个含有sgc8c序列的LAMP扩增反应双茎环模板,当该双茎环模板与CCRF-CEM细胞孵育一段时间后,核酸适配体将特异性捕获肿瘤细胞,再通过洗涤除掉未被结合上细胞的双茎环链,然后进行下一步LAMP扩增反应,通过对双茎环的定量检测,便可实现对CCRF-CEM细胞的定量分析。该方法可以特异性的检测出CCER-CEM细胞的数量为1000个,这为实现高特异性和高灵敏度的肿瘤细胞的检测提供了一种新的思路。二、基于磁分离技术的恒温指数扩增(EXPAR)法检测肿瘤细胞的研究基于以上研究思路,继续以CCRF-CEM细胞作为检测的目标细胞,探究利用EXPAR扩增技术来实现高灵敏的肿瘤细胞的检测。EXPAR技术与LAMP技相比,设计更为简便,所需扩增时间更短,而且利用磁球(MB)来连接核酸适配体会更加牢固,磁分离技术也更易实现监控和去除。具体研究方案如下,首先将修饰好的磁球连接上核酸适配体sgc8c,再设计一条寡核苷酸链可互补杂交于该核酸适配体上。然后将此复合物(磁球-核酸适配体-寡核苷酸链)与CCRF-CEM细胞共同孵育一段时间后,核酸适配体sgc8c就会捕获CCRF-CEM细胞,从而释放出寡核苷酸链。继续以此寡核苷酸链作为EXPAR扩增反应的目标链,再设计一条EXPAR扩增的双功能型模板链,便于下一步扩增反应。实验结果可通过对寡核苷酸链的实时检测来实现对肿瘤细胞的检测。该方法结合了核酸适配体和等温指数扩增二者的优势可高灵敏的实现10个目标细胞的检测,线性范围可跨越3个数量级,构建了一种简便、高效、可操作性高的肿瘤细胞的检测方法。除此之外,通过选择不同的核酸适配体可实现对不同的肿瘤细胞的捕获,从而实现对不同肿瘤细胞的高特异性检测,这在肿瘤细胞检测方面有着巨大的发展潜力。
【图文】：

示意图,修饰电极,适配体,核酸

Ｃ＾－Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ邋ＤＮＡ逡逑ｆｃｌｏｏｆｎｇ邋＋邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ逡逑图１．１基于Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ技术筛选Ａｐｔａｍｅｒ原理示意图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ａｐｔａｍｅｒ邋ｕｓｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ逡逑近年来，核酸适配体可以在体外用来识别不同的肿瘤细胞［９］，又因为其某些逡逑独特的性质，使得它们有可能成为比抗体更有效的选择对象。核酸适配体的优势：逡逑第一，它们能从合成库中进行体外筛选；第二，一旦筛选成功，就可通过聚合酶逡逑链式反应进行持续扩增，扩增产物不仅量多，而且质优？，第三，由于核酸适配体逡逑化学结构简单＂°］，因此可以根据不同目的对其进行化学修饰；第四，核酸适配体逡逑比抗体在某些极端情况下（例如：温度、盐度、极端ｐＨ条件的耐受力等）表现逡逑的更加稳定。被选择上的核酸适配体具有高亲和性［１１］，细胞特异性以及它们能筛逡逑选出表面没有生物标记物的特定类型的肿瘤细胞等优势。更为重要的是，，核酸适逡逑配体若与寡核苷酸链通过碱基互补配对原理杂交成特定的结构［１２］

原理图,电化学传感器,原理图,适配体

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ａｐｔａｓｅｎｓｏｒ逡逑于核酸适配体的荧光检测法逡逑华教授带领的团队依然以核酸适配体为基础，但是通过利用荧光实现了对肿瘤细胞的检测［２９］。该实验原理如图１．４所示，单链的富含Ｇ序列，它可增敏Ｔｂ３＋荧光。核酸适配体探针（ＡＰ）为ＳＰ时其也可与蛋白ＭＵＣＩ特异性结合。当体系中存在乳腺癌细胞核酸适配体探针便会快速的识别ＭＣＦ－７细胞并与其相结合，经Ｐ探针和Ｔｂ３＋离子。由于溶液中的核酸适配体探针结合了肿瘤细与ＳＰ探针相互杂交，而ＳＰ探针与Ｔｂ３＋共同存在时，便可增强可以通过加入ＳＰ，邋Ｔｂ３＋离子前后的荧光信号变化情况来实现对乳检测。若体系中不存在ＭＣＦ－７细胞，ＡＰ探针就会和ＡＰ探针相互强Ｔｂ３＋的荧光信号。该实验的最低检出限为７０个细胞，实验数据细胞范围内呈良好的线性关系。逡逑Ｘｅｘ邋２９０ｚｎｎ邋Ｘｃｍ邋５４０邋ｎｍ逡逑．ｍ邋４邋二邋”Ｃｎ逦ＡｄｄＴｂ＼邋■逦＾逡逑
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.71;R730.43

【参考文献】