rmhTRAIL联合硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞株中miR-17-5p和miR-886-5p的影响及其意义

发布时间：2020-04-21 04:38

【摘要】：背景和目的多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是继非霍奇金淋巴瘤之后的第二种常见血液系统恶性疾病,在恶性血液疾病中占13%。目前尚无法治愈。硼替佐米(bortezomib,BTZ)是第一代蛋白酶体抑制剂,其对多发性骨髓瘤的疗效显著,以PD为主的方案为国内外指南推荐的一线治疗方案,且硼替佐米(万珂)于2017年9月进入我国国家医保目录,使得更多的多发性骨髓瘤中国中国患者可以用上此药。不过,为了进一步提高疗效,在PD方案基础上加用辅助药物依然是血液科医师治疗MM时面临的挑战。重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(recombinant mutant of human TRAIL,rmh TRAIL)是一种重组蛋白类抗肿瘤药物,由我国北京沙东生物公司研制并且正在进行rmh TRAIL为主的方案治疗难治复发多发性骨髓瘤的临床试验。rmh TRAIL联合硼替佐米可能成为更适合中国多发性骨髓瘤患者的方案。表观遗传学引入对疾病的分层、治疗和用药等有重大的指导作用。微小RNA可以在转录的调节,蛋白的表达等诸多方面影响生命活动。mi R-17-5p和mi R-886-5p为调节肿瘤表达两种重要微小RNA,在乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤中,已经被广泛研究,单尚无其和多发性骨髓瘤的相关报道。由上背景,本课题旨在探索以下问题。1.探索rmh TRAIL单药对多发性骨髓瘤细胞株增殖抑制的影响。2.测量rmh TRAIL药物处理后多发性骨髓瘤中mi R-17-5p和mi R-886-5p的变化。3.探索BTZ单药及rmh TRAIL联合BTZ对多发性骨髓瘤细胞株增殖抑制的影响。4.测量BTZ单药及rmh TRAIL联合BTZ处理后多发性骨髓瘤中mi R-17-5p和mi R-886-5p的变化。方法1.培养人多发性骨髓瘤细胞株U266B1和NCI-H929。使用CCK-8法测量rmh TRAIL(0/78.125/312.5/1250/5000/20000ng/ml)对其增殖抑制的影响,并采用流式细胞术的方法测量细胞凋亡,MM细胞分别使用药物处理后,提取其中的mi R-886-5p和mi R-17-5p,比较含量的差异,通过统计学分析是否和药物作用呈现相关性。2.培养人多发性骨髓瘤细胞株U266B1和NCI-H929。使用CCK-8法测量rmh TRAIL(20000ng/ml)联合不同浓度的BTZ(10/20/40/80/160n M)对其增殖抑制的影响,并采用流式细胞术测量细胞凋亡率。MM细胞分别使用药物处理后,提取其中的mi R-886-5p和mi R-17-5p,利用PCR的方法比较含量的差异,通过统计学分析是否和药物作用呈现相关性。结果1 CCK-8法检测rmh TRAIL对多发性骨髓瘤细胞增殖抑制的影响rmh TRAIL对多发性骨髓瘤NCI-H929细胞株具有增殖抑制性。不同剂量rmh TRAIL(0/78.125/312.5/1250/5000/20000ng/ml)RMHTRAIL作用于NCIH929细胞,24h增殖抑制率的变化趋势为,(-1.34±0.45)%增加到(35.66±0.39)%,48h增殖抑制率从(6.53±0.33)%增加到(52.23±0.96)%,72h增殖抑制率从(19.73±0.84)%增加到(70.04±0.56)%,呈时间依赖性和浓度依赖性(P0.05)。RMHTRAIL处理多发性骨髓瘤细胞24h、48h、72h后的IC50值分别为(63579.532±4.803)ng/ml,(15580.413±4.193)ng/ml,(5181.069±3.714)ng/ml。与NCI-H929细胞形成鲜明对比的是,不同剂量的rmh TRAIL(0/78.125/312.5/1250/5000/20000ng/ml)rmh TRAIL作用于U266B1细胞,24h增殖抑制率的变化趋势为,(-5.62±0.24)%增加到(4.66±0.14)%,48h增殖抑制率从(2.23±0.32)%增加到(7.84±0.36)%,72h增殖抑制率从(1.73±0.32)%增加到(9.04±1.26)%,不呈现时间依赖性和浓度依赖性(P0.05)。2 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测rmh TRAIL处理多发性骨髓瘤后的细胞凋亡率取rmh TRAIL的IC50浓度作用于作用U266B1和NCI-H929细胞48h后,U266B1细胞凋亡率从(6.61±0.67)%增加到(7.06±0.28)%,而NCI-H929细胞的凋亡率从(5.59±0.03)%增加到(27.13±1.35)%。使用SPSS软件进行统计学处理,发现rmh TRAIL对NCI-H929的增殖抑制有统计学意义(p0.05),而对于U266B1细胞则无统计学意义(p0.05)。3 rmh TRAIL对MM细胞中mi R-17-5p和mi R-886-5p的影响rmh TRAIL处理U266B1细胞后,使用Trizol试剂提取其中的micro RNAs并行反转录,PCR,测量mi R-17-5p和mi R-886-5p在细胞中的含量变化无统计学意义。rmh TRAIL处理NCI-H929细胞后,mi R-17-5p和mi R-886-5p含量变化有统计学意义,两者的含量均明显降低。4 CCK-8法检测BTZ及rmh TRAIL联合BTZ对多发性骨髓瘤细胞增殖抑制的影响rmh TRAIL对多发性骨髓瘤NCI-H929细胞株具有增殖抑制性。不同剂量BTZ(10/20/40/80/160n M)作用于NCI-H929细胞,24h增殖抑制率的变化趋势为,(6.79±0.79)%增加到(42.02±0.56)%,48h增殖抑制率从(12.14±0.85)%增加到(69.99±0.73)%,72h增殖抑制率从(14.10±0.51)%增加到(81.70±1.28)%,呈时间依赖性和浓度依赖性(P0.05)。BTZ处理多发性骨髓瘤细胞24h、48h、72h后的IC50值分别为(211.95±1.87)ng/ml,(73.78±1.87)ng/ml,(56.22±1.75)ng/ml。不同剂量BTZ(10/20/40/80/160n M)作用于U266B1细胞,24h增殖抑制率的变化趋势为,(6.29±0.31)%增加到(9.25±0.59)%,48h增殖抑制率从(7.54±0.21)%增加到(56.97±0.85)%,72h增殖抑制率从(12.71±0.22)%增加到(70.23±0.76)%,不呈现时间依赖性和浓度依赖性(P0.05)。BTZ处理多发性骨髓瘤细胞U266B1种系24h、48h、72h后的IC50值分别为(216.13±2.33)ng/ml,(121.68±2.09)ng/ml,(72.03±1.86)ng/ml。rmh TRAIL联合BTZ得到了和BTZ单药相似的结果。不同剂量BTZ(10/20/40/80/160n M)作用于U266B1细胞,24h增殖抑制率的变化趋势为,(2.61±0.90)%增加到(54.26±0.72)%,48h增殖抑制率从(8.73±0.65)%增加到(53.95±1.46)%,72h增殖抑制率从(11.63±0.85)%增加到(72.88±1.24)%,呈时间依赖性和浓度依赖性(P0.05)。rmh TRAIL联合不同剂量BTZ(10/20/40/80/160n M)作用于NCI-H929细胞,24h增殖抑制率的变化趋势为,(55.91±0.48)%增加到(92.56±0.54)%,48h增殖抑制率从(60.25±1.30)%增加到(92.58±1.52)%,72h增殖抑制率从(72.52±0.81)%增加到(93.23±1.09)%,不呈现时间依赖性和浓度依赖性(P0.05)。5 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测rmh TRAIL处理多发性骨髓瘤后的细胞凋亡率取BTZ的IC50浓度作用于作用U266B1和NCI-H929细胞48h后,U266B1细胞凋亡率从(5.89±0.18)%增加到(26.43±0.86)%,双药联合的增殖抑制率为(26.95±1.87)。而NCI-H929细胞的凋亡率从8.78±0.99)%增加到(24.32±0.53)%,双药联合的增殖抑制率达到(30.35±1.35)。使用SPSS软件进行统计学处理,发现BTZ组及RMHTRAIL联合BTZ组对NCIH929和NCI-H929细胞的增殖抑制有统计学意义(p0.05)。6 BTZ及rmh TRAIL联合BTZ对MM细胞中mi R-17-5p和mi R-886-5p的影响BTZ单药及RMHTRAIL联合BTZ处理U266B1细胞后,mi R-17-5p和mi R-886-5p在细胞中的含量变化无统计学意义。BTZ单药及RMHTRAIL联合BTZ处理NCI-H929细胞后,mi R-17-5p和mi R-886-5p含量变化有统计学意义,两者的含量均明显降低。小结1.rmh TRAIL对多发性骨髓瘤细胞株NCI-H929具有增长抑制,对于多发性骨髓瘤细胞U266B1无增殖抑制作用。2.rmh TRAIL处理NCI-H929细胞,其中mi R-17-5p和mi R-886-5p的减少有统计学意义,而对于U266B1细胞则无统计学意义。3.BTZ对MM细胞U266B1和NCI-H929均有较明显的抑制作用。BTZ联合rmh TRAIL对NCI-H929具有显著的抑制作用,且双药表现出协同作用,对于U266B1细胞同样具有增殖抑制作用,但是两药无协同作用。4.rmh TRAIL联合BTZ处理多发性骨髓瘤细胞NCI-H929和U266B1,其中mi R-17-5p和mi R-886-5p的减少有统计学意义。
【图文】：

细胞,统计学意义,两独,药物浓度

图 2.4 rmhTRAIL 处理 U266B1 细胞和 NCI-H929 对其凋亡率的影响：A1：rmhTRAIL 处理U266B1 细胞空白对照；A2：rmhTRAIL 处理 U266B1 细胞实验组；B1：rmhTRAIL 处理 NCI-H929 细胞空白对照；B2：rmhTRAIL 处理 NCI-H929 细胞实验组。rmhTRAIL 药物浓度 20000ng/ml，作用 48 小时后，U266B1 细胞，其细胞凋亡率从（6.61±0.67）%增加到（7.06±0.28）%，差异无统计学意义。对于NCI-H929 细胞，细胞凋亡率从（5.59±0.03）%增加到（27.13±1.35）%。差异有统计学意义（p＜0.05）。依据两独立样本的 t 检验的结果显示，rmhTRAIL 对于 U266B1 细胞的凋亡作用 p＜0.05，无统计学意义，而 rmhTRAIL 对于 NCI-H929 的凋亡有统计学意义。2.4 rmhTRAIL 处理 MM 细胞对 miR-17-5p 和 miR-886-5p 的定量分析1.2

细胞,协同作用,单独处理,合并处理

ea 代表 E（rmhTRAIL），eb 代表 E（BTZ）。E（rmhTRAIL）rmhTRAIL 单独处理的细胞抑制率，e（BTZ）为 BTZ 单独处理的细胞抑率，e（rmhTRAIL+BTZ）为两药合并处理的细胞抑制率。计算 q 值，若在 0.85-1.15 之间，则两药作用单纯相加，其值在 1.15-2.0 之间，两药表协同作用，其值大于 2.0，则两药联合作用明显增强，，若其值在 0.85-0.5间，则两药表现为拮抗作用，而小于 0.55 则为明显拮抗。对于 U266B1 细胞，q 值为 0.85，而对于 NCI-H929 细胞，q 值达到了1.21，两种药物出现了增强的协同作用。证明了对于 U266B1 细胞，两药为单纯相加，而对于 NCI-H929 细胞，两药表现为协同作用。2.7 流式细胞术测量凋亡
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.3

【参考文献】