CD147诱导肝细胞极性丢失促进肝癌进展的分子机制研究

发布时间：2020-04-22 17:03

【摘要】：肝细胞具有独特的极性结构,其中两个相邻细胞形成胆汁腔面(即顶端膜),其余区域为窦状间隙面(即基底侧膜)。肝细胞极性的建立和维持对于正常细胞的生理功能和肝组织稳态至关重要,该事件需要细胞粘附分子、极性蛋白复合物、细胞外基质和细胞内运输体系共同协调完成。越来越多的证据表明,上皮细胞极性的丢失会导致细胞粘附减弱和过度增殖,诱导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),最终促进肿瘤进展,如肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。然而,导致HCC进展的肝细胞极性结构改变及其分子机制仍未知。CD147是I型跨膜糖蛋白,在肝癌细胞高度表达,而CD147是否也表达在肝非实质细胞以及与肝癌进展的相关性并未完全揭示。我们之前的报道表明,转化生长因子-β1(transform growth factor-1,TGF-β1)-CD147信号诱导EMT,促进HCC的发生和转移。在犬肾上皮细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)中,研究者鉴定出了CD147的基底侧膜分选信号,为C末端结构域中的亮氨酸-252。携带基底侧膜定位信号的CD147有助于单羧酸转运蛋白1(MCT 1)/CD147异源复合物在肾细胞基底侧膜的极性靶向定位。但是,关于在肝细胞上,CD147是否具有极性分布,以及在肝癌进展中是否参与了肝细胞极性的丢失,目前还未知。针对上述科学问题,本研究旨在明确1)肝癌进展中CD147在肝脏组织中的细胞表达谱;2)CD147在肝细胞膜上的极性分布及其临床意义;3)CD147表达对肝细胞极性的影响及其促癌的分子调控机制。本研究分为三部分。第一部分:肝癌进展中CD147的肝脏细胞表达谱研究。我们采用二乙基亚硝胺/苯巴比妥(N-diethylnitrosamine/phenobarbital,DEN/PB)两阶段诱导方式,体内探索HCC时间依赖性的发展过程。DEN/PB诱导第五个月,肿瘤形成,并伴随诱导而逐渐发展。给药后第1-12个月收集肝脏样本,明确CD147在肝细胞、内皮细胞、肝星状细胞和巨噬细胞中的定位。免疫组织化学分析显示在DEN/PB诱导的第1-8个月期间,CD147在肝脏肿瘤中表达上调。CD147的表达分别与CK18(肝细胞标志物,r=0.7857,P=0.0279),CD31(内皮细胞标志物,r=0.9048,P=0.0046),和CD68(巨噬细胞标志物,r=0.7619,P=0.0368)呈正相关。在DEN/PB诱导起始和肿瘤形成的早期阶段,CD147与α-SMA之间也存在正相关(r=0.8857,P=0.0333)。免疫荧光和荧光原位杂交显示CD147与CK18、CD31、α-SMA和CD68具有共定位。此外,在DEN/PB诱导的HCC发展中,CD147与微血管密度(r=0.7857,P=0.0279)、Ki-67(r=0.9341,P=0.0022)呈显著性正相关。第二部分:CD147诱导肝细胞极性丢失的作用研究。在3D人肝癌细胞球(HepG2)和小鼠肝癌组织中,免疫荧光显示:CD147与基底侧膜标志物钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(Na~+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)、integrinβ1具有共定位,而与顶端膜标志物多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)、F-actin没有共定位,即CD147位于肝细胞的基底侧膜。在192例人肝癌组织中,通过CD147免疫组织化学染色,将其分为极性分布和非极性分布,统计学分析显示:CD147极性分布与HCC分化程度呈正相关(r=0.2060,P=0.004);生存分析显示,具有CD147极性分布的HCC患者的总体生存率明显高于CD147非极性患者(P=0.021)。可见,CD147在肝细胞上的极性分布具有临床意义。为了阐明CD147表达对肝细胞极性的影响,我们建立了CD147过表达和CD147干涉的HCC细胞系。利用这些细胞系,证实CD147促进TGF-β1介导的肝细胞极性丢失,以及E-cadherin、Par3表达的下调。更重要的,CD147过表达可以直接诱导肝细胞极性丢失。第三部分:CD147过表达诱导肝细胞极性丢失的分子机制研究。在HCC细胞中,CD147过表达诱导E-cadherin的内吞和下调,同时Par3表达下调,进而促进肝细胞去极化。相反,干涉和敲除CD147后,E-cadherin和Par3表达上调。探究其机制我们发现:CD147过表达促进Src活化,随后招募泛素连接酶Hakai,使E-cadherin泛素化和溶酶体降解,导致Par3表达的减少和β-catenin的入核。该信号通路是通过CD147与integrinβ1的竞争性结合来启动,其阻断fibronectin的Arg-Gly-Asp序列与integrinβ1之间的相互作用。加入靶向integrinα5和β1特异性抗体,会逆转由CD147过表达引起的E-cadherin和Par3表达的降低。人HCC组织的mRNA结果显示:CD147的表达和Par3(r=-0.3230,P=0.0221)、E-cadherin(r=-0.2824,P=0.0469)呈负相关;CD147的表达与integrinα5(r=0.2957,P=0.0371)、integrinβ1(r=0.3043,P=0.0317)呈正相关。上述所有结果都表明了由癌相关基因CD147调控的顶端-基底(apical-basal)细胞极性机制在HCC进展中的重要作用,即1)CD147在肝实质和间质细胞中表达上调,并参与DEN/PB诱导的HCC发展中的血管生成和肿瘤细胞增殖。2)CD147位于人肝细胞的基底侧膜,这与HCC进展密切相关。3)CD147通过“CD147-integrinα5β1-E-cadherin泛素化-Par3降低和β-catenin入核”的信号通路调控肝细胞极性。本研究补充了HCC发展的机制,并提供了基于靶向CD147治疗HCC的新理论。
【图文】：

信号通路,军医大学,胰岛素样生长因子受体,肝细胞生长因子

空军军医大学博士学位论文突变，以及 mTOR（mammalian target of rapamycin）信号被破坏[6,7]；胰岛素样生长因子受体 1（insulin-like growth factor receptor 1，IGFR 1）信号被激活；肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和 c-MET 信号通路的失调也很常见的[5]。另外，HCC 中，还发现 β-catenin 的激活、Wnt 受体的过表达或 E-cadherin 的失活，促使 Wnt 信号通路被激活。

上皮细胞,极性,侧膜,顶端

细胞形态形成，胚胎发生中的细胞迁移，神经冲动沿轴突的正确传递，免疫细胞的趋化性以及分子穿过上皮片层的定向运输[55]。我们研究所关注的是上皮细胞中的顶端/基底极性（apico-basal，AB）排列，但也存在其他类型的极性，即平面细胞极性（planar cell polarity，PCP），，其在上皮细胞中垂直于 AB 轴，前后极性（front-rear，FR 或 anterior-posterior，AP），其存在于迁移细胞、神经元和进行不对称分裂的细胞中，常在间质细胞中发挥作用。1. 上皮细胞极性结构上皮细胞是构成哺乳动物体内大多数器官的基础，约占人类所有癌症中来源的90％。正常上皮细胞的极化是通过细胞组分沿着内部顶端-基侧轴的不对称分布而形成的，分为顶端区域，其面向内腔，以及基底侧膜区域，其侧膜与相邻细胞连接，底部附着于基底膜，两个区域由紧密连接（tight junction，TJ）分隔而成（图 2）。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

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