乏氧微环境在促进乳腺癌肿瘤再生细胞增殖中的作用及其机制研究

发布时间：2020-04-22 20:59

【摘要】：第一部分乏氧微环境对乳腺癌肿瘤再生细胞增殖的影响目的:肿瘤干细胞(CSCs)是一群具自我更新,多能分化及启动体内肿瘤生长潜能等干细胞特性的肿瘤细胞,也是肿瘤发生、发展、治疗抵抗和治疗后复发的关键驱动因素。乏氧是调节肿瘤干细胞自我更新的关键微环境因子,同时也可以使肿瘤干细胞富集,但是氧是否可以直接促进肿瘤干细胞的增殖并不清楚。本部分研究基于三维软纤维蛋白基质胶(3D fibrin)分离筛选出乳腺癌肿瘤干细胞(定义为肿瘤再生细胞,TRCs),利用血管内皮生长因子抑制剂构建肿瘤乏氧模型,探讨体内外乏氧对肿瘤干细胞增殖的影响。方法:(1)使用苹果酸舒尼替尼构建肿瘤乏氧模型;观察两组肿瘤体积的大小,免疫荧光染色检测肿瘤组织内的乏氧区域及血管分布情况;(2)使用流式细胞仪从乳腺癌肿瘤组织中分选出ALDH高表达及低表达的肿瘤细胞,并将其接种至三维软纤维蛋白基质胶中,观察比较ALDH~+和ALDH~-细胞形成的克隆数目。(3)Real time PCR检测两组肿瘤组织中干性基因的表达(ALDH1A1、OCT4、KLF4、SOX2),Western blot检测ALDH1A1、PCK2的蛋白表达水平。(4)利用BrdU免疫荧光染色观察两组肿瘤组织中肿瘤干细胞的增殖情况。(5)将MCF-7、BT474及人原代乳腺癌TRCs分别置于常氧(21%O_2)和乏氧(1%O_2)的条件下培养6天,统计克隆体积及克隆数量;(6)利用CoCl_2模拟乏氧,观察不同浓度CoCl_2对MCF-7 TRCs克隆体积及数量的影响;(7)利用BrdU染色,观察两组细胞的增殖,同时利用PI和AnnexinV双染检测其凋亡;(8)采用Real time PCR检测干性基因在两组细胞中的表达差异。(9)将不同数量的常氧与乏氧MCF-7 TRCs接种于NOD-SCID小鼠乳腺垫下,观察两组的成瘤率及成瘤时间的差异。结果:(1)舒尼替尼处理组肿瘤体积明显缩小、乏氧区域明显增多,CD31染色显示血管分布减少。(2)ALDH~+肿瘤细胞形成的克隆数目显著高于ALDH~-的肿瘤细胞;(3)舒尼替尼处理组干性基因表达水平明显升高,ALDH蛋白表达上调,PCK2蛋白表达下调。(4)舒尼替尼处理组乏氧区域内ALDH及BrdU表达升高。(5)在乏氧情况下,MCF-7、BT474及人原代乳腺TRCs克隆体积明显增大。(6)在一定的浓度范围内,随着CoCl_2浓度的增加,MCF-7 TRCs克隆体积逐渐增大。(7)与常氧对照相比,乏氧组MCF-7 TRCs显著增加DNA合成(S期)。(8)乏氧组肿瘤干性基因(CD133、OCT4、KLF4、ALDH、SOX2)的表达明显高于常氧组。(9)乏氧组的成瘤能力显著高于常氧组。结论:乏氧微环境可以明显促进乳腺癌肿瘤再生细胞的增殖,诱导其肿瘤干细胞表型的表达,同时明显增强乳腺癌肿瘤再生细胞在体内的致瘤性。第二部分乏氧微环境介导的TCA循环重塑与ROS生成的机制研究目的:通过分析TCA循环中间代谢产物的变化,探索乏氧介导ROS升高的机制;进一步探究ROS促进乳腺癌肿瘤再生细胞增殖的机制。方法:(1)在常氧和乏氧情况下,使用ROS荧光探针检测MCF-7以及人原代乳腺癌肿瘤再生细胞(TRCs)中的ROS水平,检测乏氧情况下经ROS清除剂NAC处理后MCF-7 TRCs细胞内ROS水平;(2)乏氧情况下,经不同浓度NAC和有氧情况下不同浓度H2O2处理后,观察MCF-7 TRCs的克隆体积;(3)乏氧情况下,使用ROS荧光探针检测MCF-7及MCF-7 TRCs细胞内ROS水平,同时在2D培养的MCF-7细胞中,加入不同浓度NAC,计数检测MCF-7细胞的增殖状况;(4)Western blot检测MCF-7及人原代乳腺癌TRCs中NF-κB和Akt的表达及NAC处理后NF-κB和Akt磷酸化水平的变化;(5)MCF-7 TRCs经NF-κB和Akt抑制剂处理后,Western blot检测NF-κB和Akt磷酸化水平,并观察MCF-7 TRCs的克隆体积的变化;(6)13C标记的葡萄糖处理MCF-7 TRCs后LC/MS/MS检测TCA循环的代谢变化;(7)Western blot检测TCA循环限速酶CS、IDH3G、OGDH的表达;(8)使用si RNA沉默MDH2、IDH3G后,观察MCF-7 TRCs克隆体积变化,同时,使用ROS荧光探针检测细胞内ROS水平;(9)使用si RNA沉默IDH3G,同时加入不同浓度的H2O2,观察MCF-7 TRCs克隆体积变化;(10)LC/MS/MS检测TCA循环中间产物柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸及苹果酸的含量;(11)使用不同浓度的α-酮戊二酸二甲酯(MOG)、琥珀酸二乙酯(SAD)、富马酸二甲酯(DMF)和L-苹果酸处理常氧MCF-7 TRCs后,ROS荧光探针检测细胞内ROS水平;(12)常氧乏氧情况下,使用LC/MS/MS检测MCF-7 TRCs细胞内GSF含量;(13)在常氧与乏氧情况下,使用NADPH及GSH试剂盒检测MCF-7 TRCs胞内NADPH/NADP+及GSH/GSSG的比值;(14)GSH-MEE处理乏氧的MCF-7 TRCs后,使用NADPH及ROS荧光探针检测细胞内NADPH/NADP+及ROS水平;(15)加入不同浓度GSH-MEE处理MCF-7 TRCs后,观察克隆体积变化;(16)使用si RNA沉默IDH3G后,检测GSF的含量变化及细胞内NADPH/DNAP+的比值。结果:(1)乏氧情况下,MCF-7、人原代乳腺癌TRCs中ROS含量升高,经NAC处理后ROS含量下降,且呈浓度梯度依赖;(2)乏氧情况下加入NAC清除ROS后,有效阻碍了TRCs的生长;反之,常氧条件下加入低浓度的H2O2可促进MCF-7 TRCs的生长;(3)常规2D培养的MCF-7细胞在乏氧条件下具有更高的ROS水平,NAC处理降低ROS水平后,乏氧所致的生长迟缓得到明显恢复。(4)乏氧导致MCF-7 TRCs中NF-κB和Akt磷酸化水平升高,加入NAC后磷酸化水平受抑制;(5)使用NF-κB和Akt抑制剂后,MCF-7 TRCs NF-κB和Akt磷酸化减弱,增殖明显被抑制;(6)13C葡萄糖同位素示踪试验显示乏氧时MCF-7 TRCs的TCA循环明显减慢;(7)乏氧时,MCF-7 TRCs中TCA循环的限速酶CS、IDH3G、OGDH的表达均下调;(8)沉默MDH2后MCF-7 TRCs细胞内ROS水平升高且克隆体积增大;而沉默IDH3G后细胞内ROS水平降低,克隆体积明显缩小;(9)H2O2可以逆转沉默IDH3G后克隆体积的缩小;(10)乏氧时,TCA循环的中间产物柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸及苹果酸均升高,且延胡索酸及苹果酸升高尤为明显;(11)不同浓度的α-酮戊二酸二甲酯(MOG)、琥珀酸二乙酯(SAD)、富马酸二甲酯(DMF)和L-苹果酸处理常氧MCF-7 TRCs后,仅DMF使细胞内ROS水平升高且与浓度呈正比;(12)与常氧相比,乏氧MCF-7 TRCs细胞内GSF比例升高且胞内NADPH/NADP+及GSH/GSSG的比例均降低。(13)GSH-MEE处理乏氧MCF-7 TRCs后,细胞内NADPH/DNAP+升高,ROS水平降低,阻碍了乏氧对于TRC生长的促进作用;(14)琥珀酰化谷胱甘肽的升高以及NADPH/NADP+的降低可通过IDH3G补救。结论:乏氧导致TCA循环流动减慢,致使中间代谢产物延胡索酸堆积,而延胡索酸积累则导致琥珀酰化谷胱甘肽的形成,在GSF的形成过程中消耗了GSH及NADPH最终导致MCF-7 TRCs内的ROS水平增加。同时,ROS水平升高激活信号分子NF-κB和Akt,促进人乳腺癌TRC的生长。第三部分HIF-1α介导的PCK2下调在乳腺癌TRCs TCA循环重塑中的作用目的:以乳腺癌MCF-7细胞为模型,探究磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK2)的下调表达对肿瘤再生细胞(TRCs)TCA循环中间代谢物(草酰乙酸、延胡索酸)的影响以及导致乏氧乳腺癌TRC中的延胡索酸积累的原因。同时进一步探究乏氧情况下PCK2下调表达的分子机制.方法:(1)乏氧情况下,Western blot检测MCF-7 TRCs中PCK2的表达情况;(2)使用四环素诱导的PCK2过表达系统,检测PCK2高表达后乳腺癌TRCs中延胡索酸,琥珀酰化谷胱甘肽(GSF)和ROS水平以及NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值;(3)利用OAA检测试剂盒检测有氧、乏氧情况下及PCK2高表达后OAA含量的变化;(4)利用同位素标记的13C葡萄糖处理MCF-7 TRCs后,使用LC/MS/MS检测PCK2过表达后TCA循环的流动情况;(5)Western blot检测MCF-7 TRCs中HIF的表达,同时沉默或过表达HIF-1α后检测PCK2蛋白的表达水平;(6)利用同位素标记的13C检测HIF-1α沉默后TCA循环的流动情况;(7)UCSC基因组浏览器和JASPAR分析PCK2的启动子区域是否存在HIF-1α结合位点,并用染色质免疫共沉淀技术进一步验证;(8)利用PCK2启动子萤光素酶测定荧光素酶的表达,以确定HIF-1α与PCK2之间的调控关系;(9)使用富马酸二甲酯(DMF)处理缺氧的MCF-7 TRCs,Western blot检测HIF-1α及PCK2的表达;结果:(1)乏氧时,MCF-7 TRCs的PCK2表达下调;(2)过表达PCK2后,延胡索酸、GSF和ROS水平降低,NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值增加;(3)乏氧时,MCF-7 TRCs细胞内OAA含量升高,PCK2过表达后OAA含量下降;(4)乏氧时,PCK2过表达后,TRCs的TCA循环加速,m+2和m+4形式的柠檬酸,α-酮戊二酸,延胡索酸和苹果酸比例升高;(5)常氧和乏氧乳腺癌TRCs均表达HIF-2α,而HIF-1α仅在乏氧的TRCs中显著上调。si RNAs沉默HIF-1α时,PCK2表达上调,过表达HIF-1α后,PCK2表达下调;(6)HIF-1α沉默后促进TCA循环的流动;(7)UCSC基因组浏览器和JASPAR分析揭示在PCK2的启动子区域存在多个HIF-1α的结合位点,并且Chip-PCR测定表明HIF-1α可以直接结合到PCK2的启动子区;(8)PCK2启动子萤光素酶测定显示,HIF-1α敲低增加萤光素酶的活性,HIF-1α过表达降低萤光素酶活性;(9)富马酸二甲酯(DMF)处理乏氧乳腺癌TRCs后,HIF-1α的表达增强,且PCK2表达降低。结论:PCK2下调导致的OAA积累阻碍了TCA循环的碳流动并导致乏氧乳腺癌TRCs中的延胡索酸积累;缺氧诱导的HIF-1α负调节PCK2表达,延胡索酸积累进一步加强了这种反馈。
【图文】：

微环境

尼治疗构建 MCF-7 瘤内缺氧微环境替尼是一种 VEGF 受体酪氨酸激酶抑制剂，在临床中用作抗血肿瘤内缺氧[47]。为了在体内探究乏氧是否可以促进肿瘤干细胞MCF-7 TRCs 注射到裸鼠皮下，并且当肿瘤长到 50-100mm3时60mg/kg/天）治疗小鼠。35 天后，将小鼠处死，应用乏氧probe）及 CD31 荧光染色评价肿瘤组织内乏氧及血管分布情况替尼处理后，小鼠肿瘤生长变缓，肿瘤体积较对照组明显缩探针 Hypoxyprobe 染色显示舒尼替尼治疗组小鼠的肿瘤组织中氧区域（图 1B）；与已有的研究结果一致，舒尼替尼处理后肿明显减少（图 1C），以上结果说明舒尼替尼治疗后可以造成肿境。

干性,增强体,干细胞,基因

华中科技大学博士学位论文800 μm); C. Vascular density was stained by CD31 antibody. (Scale bar, 0.5 cm).2.2 乏氧增强体内肿瘤干细胞的干性既往研究证实，乏氧可以通过上调诸如 OCT4、SOX2 和 NANOG 等干性基因的表达，这些基因在维持干细胞自我更新或调节细胞自我分化中起到重要作用。为了检测体内乏氧能否增强肿瘤细胞干细胞样表型，，我们用 Real-time PCR,Western blot 检测肿瘤组织内干性相关基因，结果显示舒尼替尼治疗组干性基因Sox2，Oct3/4 和 KLF4 表达升高（图 2A）。乙醛脱氢酶 1（ALDH1）通常用于标记乳腺癌干细胞样细胞[48]，因此我们通过 Real-time PCR, Westernblot 检测了ALDH1 的表达，结果发现，舒尼替尼治疗组 ALDH1 在基因和蛋白水平上表达均显著升高（图 2B）。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

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