TIGAR在食管鳞状细胞癌进展中的作用机制研究

发布时间：2020-04-25 06:06

【摘要】：背景和目的:食管鳞癌是我国特色的恶性消化道肿瘤,拷贝数变异是其主要的基因组改变类型。我们前期通过对94对食管鳞癌组织及其配对血液样本的全基因组测序数据分析,鉴定出23个拷贝数扩增区段,包含1591个拷贝数扩增基因。通过对基因组和转录组数据的整合分析,我们发现其中有149个拷贝数扩增的基因在肿瘤组织中异常高表达,提示这些基因可能在食管鳞癌发生发展中起重要作用。本研究旨在通过高通量功能筛选寻找具有功能的拷贝数扩增基因,研究其在食管鳞癌进展中的作用机制,为食管鳞癌提供潜在的治疗靶点。方法:运用高通量功能筛选方法结合siRNA文库对149个候选基因进行功能筛选。采用转录组测序数据分析、免疫印迹以及免疫组化的方法,从mRNA水平和蛋白水平上检测目的基因在食管鳞癌组织以及癌旁组织中的表达情况。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术以及慢病毒感染方法在食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE150中将目的基因敲除或过表达,在体内外分析扰动其表达对细胞增殖能力的作用。通过细胞活力检测、克隆形成、ATP水平检测、免疫印迹等细胞学、生物化学以及分子生物学实验,探究拷贝数变异基因影响肿瘤增殖的作用机制。用IC50评估扰动目的基因后细胞对化疗药物敏感性的改变。结果:我们发现TIGAR是149个候选基因中对肿瘤细胞增殖影响最显著的基因,过表达TIGAR促进食管癌细胞在体内外的增殖。TIGAR高表达抑制糖酵解途径,但促进旁通路磷酸戊糖途径,从而产生大量5-磷酸-核糖和NADPH,降低食管鳞癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。TIGAR高表达通过激活p-AMPK促进谷氨酰胺代谢途径为细胞增殖提供能量,使细胞高度依赖谷氨酰胺代谢并对谷氨酰胺酶抑制剂敏感性升高。抑制谷氨酰胺代谢或AMPK可消除TIGAR高表达诱导的细胞增殖。谷氨酰胺剥夺或谷氨酰胺酶抑制剂与5-氟尿嘧啶具有协同效应,可有效抑制TIGAR扩增或过表达的食管鳞癌细胞的增殖。结论:TIGAR拷贝数扩增和高表达促进磷酸戊糖途径和谷氨酰胺代谢途径,进而促进食管鳞癌细胞增殖。TIGAR高表达降低食管鳞癌细胞对化疗药5-氟尿嘧啶的敏感性,而联合使用谷氨酰胺酶抑制剂可有效抑制TIGAR过表达的食管鳞癌细胞的增殖,提示TIGAR可能是食管鳞癌个体化治疗的标志物。
【图文】：

北京协和医学院巾国医学科学院博N学位论义逦结果逡逑结果逡逑一、食管鳞癌中１４９个拷贝数扩增基因的筛选逡逑通过对９４对食管鳞癌患者的癌组织和配对的血液组织或近端癌旁组织进行全逡逑基因组测序以及转录组测序，绘制食管癌突变谱以及表达谱。通过全基因组测序检逡逑测基因拷贝数量，继而通过环形二元分割法将全基因组原始数据分成有相同数量的逡逑拷贝数区域，通过ＧＩＳＴＩＣ２．０计算得到２３个拷贝数扩增区域，，包含１５９１个基因。逡逑使用Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ软件对转录本进行组装并计算基因ｍＲＮＡ表达水平。通过秩相关分逡逑析检测ＤＮＡ水平拷贝数改变与ｍＲＮＡ水平表达改变的相关性，寻找随着拷贝数扩逡逑增ｍＲＮＡ表达升高的基因（拷贝数变异与基因表达改变一致，Ｐ＜０．０５，ｒ＞０．３５），逡逑得到４２１个基因。进一步通过转录组表达分析筛选癌与癌旁差异表达基因（尸＜０．０５，逡逑ＦＣ２邋１．３），共得到１４９个候选进入后续的功能筛选阶段（表１，图１）。逡逑

图３人类常见肿瘤中７７Ｇ／１／？拷贝数变异逡逑在癌症基因组数据库邋ｃＢｉｏ邋Ｃａｎｃｅｒ邋Ｇｅｎｏｍｉｃｓ邋Ｐｏｒｔａｌ邋（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／）分析邋７７Ｇｄ尺基逡逑因在常见肿瘤中的拷贝数变化情况。图中结果表明基因在２０个肿瘤基因组的研究中均逡逑存在拷贝数扩增。柱形图表示Ｊ７（Ｌ４ｉ？的拷贝数变异频率。其中蓝色表示拷贝数缺失，红色表逡逑示拷贝数扩增。逡逑另外，我们利用ＴＣＧＡ数据库中其余鳞癌的数据进行分析，结果表明７Ｘ４Ｇｉ？在逡逑其余三种淲状细胞癌（宫颈鳞癌、头颈部淲癌、肺鳞癌）中拷贝数与ｍＲＮＡ的表达逡逑均呈现显著的正相关（宫颈鳞癌：ｒ＝邋０．３９，尸＜邋０．００１，头颈部淲癌：ｒ邋＝邋０．３３，尸＜逡逑０．００１；肺淲癌：ｒ邋＝邋０．４６，尸＜０．００１；图邋５Ａ）。７７（２４７？的拷贝数取邋ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ邋数值后逡逑总体趋势上与ｍＲＮＡ水平改变一致（图５Ｂ）。逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1

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本文编号：2639895