HNF3β在结直肠癌细胞增殖、侵袭和转移中的作用及其机制的初步探讨

发布时间：2020-04-25 08:50

【摘要】：结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤,在中国是癌症相关性死亡的第三大原因~([1])。结直肠癌的预后与肿瘤侵袭和转移的程度直接相关。尽管目前在早期诊断、根治性手术、放疗和新辅助化疗等几个方面对结直肠癌的治疗取得了可观的进展,但仍然没有令人满意的治疗方法,而且结肠癌患者的死亡由于患者的复发或转移而有所增加~([2])。对肿瘤复发和早期肿瘤转移的诊断和预防至关重要,因此有必要探索新型分子标志物对结肠癌预后的作用。但迄今为止,结直肠癌发生、复发或转移潜在的调控机制尚不清楚,很少有新的预后生物标志物被发现和鉴定。转录因子HNF 3β(肝细胞核因子3β)又称FOXA2(forkhead box A2),属于肝细胞核因子(HNF)家族。由HNF1,HNF3,HNF4,HNF6和CCAAT/增强子结合蛋白(CEBPs)组成的肝细胞核因子(HNF)家族在发育中起关键作用~([3])。之前有研究表明,HNF3转录因子,特别是HNF3α/FOXA1,HNF3β/FOXA2和HNF3γ/FOXA3在胃肠道分化中起重要作用~([4])。HNF3βmRNA在胚胎发生时首先表达,并在前原条和节间的原肠期中观察到,随后在肠中表达~([5-7])。由于会导致节点和脊索发育失败,HNF3β缺陷可导致胚胎死亡~([8])。它不仅在胚胎发育(包括节点,神经系统和内胚层衍生结构的形成)中起着关键作用,还通过调节正常胆汁酸和脂质体内平衡调节出生后发育~([9])。许多研究表明,HNF3β低表达与肿瘤发生、进展和转移密切相关,这在几种肿瘤包括肝细胞癌、肺癌、胰腺癌、胃癌和甲状腺癌中都有报道~([10-14])。然而,HNF3β在结直肠癌中的作用尚未见有研究,HNF3β在结直肠癌进展中的作用仍不明确。在本研究中,我们分析了HNF3β在174例结肠癌患者中的表达水平及其对患者的预后作用以及对结肠癌细胞的肿瘤生物学功能的影响。第一部分HNF3β在结直肠癌组织中的表达情况及其临床意义研究目的:研究结直肠癌组织标本中HNF3β的表达情况,分析其表达与患者临床参数之间的关系,并研究其对患者预后的影响。研究方法:取8例结直肠炎症组织、14例结直肠低级别上皮内瘤变、18例结直肠高级别上皮内瘤变、174例结直肠肿瘤切除标本和3例正常结直肠组织,通过免疫组化染色方法检测HNF3β蛋白在各组织中的表达情况。以上所有组织标本均来源于海军军医大学第二附属医院长征医院普通外科在2010年10月-2011年9月收治采集的患者标本。这些患者在术前均未接受新辅助化疗或放疗,术后II期、III期和IV期患者按Xelox化疗方案(奥沙利铂和卡培他滨)进行化疗。通过从患者的电子病历中搜集和电话随访的方法整理出病人的临床资料和随访数据,采用Yates校正或Fisher精确概率法卡方(?2)检验分析和Spearman等级相关分析将HNF3β与患者临床数据之间进行相关性统计学分析;Kaplan-Meier法绘制结直肠癌病人的生存曲线,Cox比例风险回归模型进行多变量分析,评价各个指标是否为患者的预后独立因素。结果:HNF3β蛋白在3例正常结直肠上皮组织、8例结肠直肠炎症组织、14例结直肠低级别上皮内瘤变组织和18例高级别上皮内瘤变组织中高表达,在174例结直肠癌组织中低表达或不表达。在174例结直肠癌组织标本中,56%的标本为低表达“+”或不表达“-”。并且统计分析后发现,HNF3β在结直肠癌和非癌性组织中的染色差异具有统计学意义,P小于0.0001。由此证明HNF3β在结直肠癌中低表达或不表达。HNF3β低表达与结直肠癌UICC临床分期、T分期、淋巴结转移数目、远处转移有无和患者预后密切相关(P0.05),而与患者年龄、性别、组织学分型、肿瘤分化程度、肿瘤所在部位无关(P0.05)。单变量分析显示HNF3β低表达和UICC临床分期、侵袭程度、淋巴结转移和远处转移与否一样,都与患者预后密切相关(P0.001)。用Cox比例风险回归模型进行多变量分析,结果显示:HNF3β低表达(HR:0.601,95%CI:0.387-0.933,P=0.023),远处转移(HR:5.890,95%CI:1.028-33.772,P=0.046)和UICC临床分期(HR:3.737,95%CI:1.611-8.668,P=0.002)都是患者总体生存期的独立预测因素,而HNF3β低表达(HR:0.606,95%CI:0.392-0.937,P=0.024),淋巴结转移(HR:0.171,95%CI:0.032-0.899,P=0.037)和UICC临床分期(HR:9.935,95%CI:2.214-44.574,P=0.003)是患者无进展生存期的独立预测因素。结论:从蛋白质水平证实HNF3β在结直肠癌组织中低表达或不表达,而在正常结直肠上皮组织、结直肠炎症组织、低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变等非癌组织中高表达。HNF3β的表达与结直肠癌UICC临床分期、T分期、淋巴结转移情况、远处转移和患者预后密切相关(P0.05),低表达HNF3β的结直肠癌患者有着极差生存期,HNF3β蛋白的表达是结直肠癌患者预后的独立预测因素。第二部分HNF3β对结直肠癌SW480细胞系增殖、侵袭和转移的影响及其可能机制研究目的:研究HNF3β对结直肠癌SW480细胞株细胞增殖、侵袭和转移的影响,并观察小鼠体外成瘤HNF3β对瘤体重量的影响,并对其可能机制进行初步探讨。研究方法:构建HNF3β慢病毒和空载病毒,分别转染sw480细胞,建立HNF3β过表达结直肠癌SW480细胞株及空载病毒SW480细胞株,利用蛋白印迹法(western blot)检测转染细胞中HNF3β的表达情况,从蛋白水平证实细胞模型构建成功。通过MTT法细胞增殖实验检测HNF3β过表达后细胞增殖能力的变化,通过细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验研究HNF3β过表达后细胞迁移能力的变化。裸鼠成瘤实验检测在动物体内HNF3β过表达后对结直肠癌肿瘤生长的影响。建立HNF3β过表达结直肠癌SW480细胞株及空载病毒SW480细胞株,利用蛋白印迹法(western blot)检测JAK/STA信号通路中的关键蛋白:IL6,JAK1和STAT3的表达情况。结果:与载体病毒SW480细胞系和正常SW480细胞株相比,SW480细胞株过表达HNF3β的细胞增殖明显减少,尤其是在第4,5,6天时(P0.05)。结肠癌SW480细胞增殖,侵袭和迁移实验中也有类似现象(P0.05)。结直肠癌SW480细胞系在裸鼠致瘤性实验中过表达显示,过表达组肿瘤重量显着低于正常组和负荷病毒组(P0.05)。在体外结直肠癌SW480细胞HNF3β过表达后,发现JAK/STA信号通路中的关键蛋白:IL6、JAK1和STAT3表达下调。结论:HNF3β的低表达与结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移特性有关,体内裸鼠移植瘤模型也证实过表达HNF3β裸鼠的瘤体更轻,这提示HNF3β可能为结直肠癌的一个抑癌基因。HNF3β可能通过JAK/STA信号通路抑制结直肠癌细胞SW480的增殖、侵袭和转移,提示HNF3β可能是结直肠癌的一个抑癌基因,但对其机制以及上下游通路需进一步探讨。
【图文】：

结直肠癌,上皮组织,高级别,癌组织

1、HNF3β 在结直肠癌和正常结直肠上皮组织、结肠直肠炎症组织、低级别上皮织、高级别上皮内瘤变组织等非癌组织中的表达情况，其中 A：a（正常结直肠织）、b（结肠直肠炎症组织）、c（结直肠低级别上皮内瘤变组织）、d（结直别上皮内瘤变组织）、e（结直肠腺癌组织）、f（结直肠粘液腺癌组织）（×2二、HNF3β 蛋白与患者临床病理参数之间的关系HNF3β 的表达与患者 UICC 临床分期、肿瘤浸润、淋巴结转移与否、有无远患者预后密切相关（P＜0.05），而与性别、年龄、组织学分型、分化程度及无关（P＞0.05），即临床分期越晚、肿瘤浸润程度越深、有淋巴结转移、有及预后不良的患者组织中 HNF3β 的表达越低。由此提示 HNF3β 可能与结直肠发展有关联，即 HNF3β 表达越低，结直肠癌恶性程度可能越高。

重组质粒,图谱,过表达,慢病毒

置入-80℃冰箱 24 小时后，移入液氮保存。HNF3β 过表达 SW480 稳定细胞株构建F3β 慢病毒过表达质粒构建 hnf3b-HA-3Flag-P2A-LUC-F2A-Puro 委托上海和元生物公司谱见图 3。表五、重组质粒 hnf3b-HA-3Flag-P2A-LUC-F2A-Puro 基本信息nk ID NM_153675 基因大小 1Human 上下游克隆酶切位点 E称 H116 Amp 抗性元件 hnf3b-HA-3Flag-P2A-LUC-F2A-Puro序引物 CMV-F CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG序引物 GLP2 CTTTATGTTTTTGGCGTCCTTCCA
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

【共引文献】