ADAM10调节胰腺癌对吉西他滨敏感性的免疫学机制研究

发布时间：2020-05-02 17:40

【摘要】：胰腺癌是一种起病隐匿、发展迅速、预后极差的消化系统恶性肿瘤,由于其早期诊断困难,治疗方法有限,因而死亡率与发病率几乎一致[1,2]。在美国,胰腺癌的死亡率已由第5位升至第4位,到2030年胰腺癌预计将成为第二大癌症死亡原因[3]。最新的流行病学数据估计,所有阶段的胰腺癌的总体5年存活率仅为8.2%,是所有实体肿瘤中最低的。几乎90%的胰腺恶性肿瘤都是胰腺导管腺癌(PDAC)。尽管几十年来外科手术和化疗都取得了进步,但PDAC患者的总体预后仍然非常差。与胰腺癌相关的最常见危险因素包括吸烟,家族史,慢性胰腺炎,肥胖,糖尿病和职业危害[4-6]。由于缺乏有效的早期检测筛查方法和极少的特定早期症状,绝大多数PDAC患者被诊断已为晚期或发生转移。虽然手术提供了唯一可能的治愈性治疗,但在诊断时只有15-20%的患者有可切除的机会,甚至在进行手术切除的患者中,大多数患者在一年内发生疾病复发。因此,化疗仍是胰腺癌辅助治疗的重要手段之一[7]。吉西他滨(也称为dFdC:2',2'-二氟脱氧胞苷)最初用于抗病毒,目前已被广泛用作各种实体瘤和某些淋巴瘤的抗癌化疗药物。自1997年以来,Burris等人发现吉西他滨可明显改善患者症状、延长患者中位生存期,吉西他滨已成为局部晚期和转移性胰腺癌的标准治疗选择,并作为放疗增敏剂在临床广泛使用,各种以该药为基础的联合治疗方案正被广泛开发。吉西他滨在表现状态和疼痛控制方面优于氟尿嘧啶(5-FU),与5-FU相比,吉西他滨的临床受益反应(CBR)更为深远,几乎高出五倍(23.8%对4.8%)[8]。然而,良好的临床反应无法转化为生存获益,可能至少部分归因于在治疗的几周内,最初敏感的肿瘤发展出对吉西他滨化疗耐药性,使其对吉西他滨不再敏感[9]。因此,对调节吉西他滨敏感性的分子基础进行研究可能为增加这种化学疗法的效率开发新的策略。这不仅会对胰腺癌患者有益,而且对吉西他滨治疗的其他恶性肿瘤患者也有益。第一部分胰腺癌ADAM10的表达与吉西他滨敏感性的临床研究目的:近期有研究表明解整合素样金属蛋白酶10(ADAM10)不仅参与肿瘤的增殖,血管生成,迁移和侵袭,还参与肿瘤的化疗耐药过程,本研究旨在检测胰腺癌ADAM10的表达差异及其与患者对吉西他滨敏感性的相关性。方法:采用免疫组化的方法在胰腺癌患者肿瘤标本中检测ADAM10,VEGF以及CD31的蛋白表达水平,并分析ADAM10表达与VEGF以及微血管密度(MVD)的相关性。应用Kaplan-Meier单因素生存分析和Cox多因素生存分析探索ADAM10表达水平与胰腺癌吉西他滨治疗效率的相关性。结果:免疫组化结果显示,ADAM10蛋白表达与微血管密度(p0.001)和VEGF表达(p0.001)均呈显著正相关。ADAM10高表达组的MVD值显著高于ADAM10低表达组(p0.001)。同时,ADAM10在胰腺癌中的高表达与组织学分级(p = 0.001),淋巴结转移(p = 0.012),神经周围浸润(p = 0.022)和肿瘤,淋巴结和转移分期(TNM)显著相关(p = 0.029)。在单变量和多变量Cox回归分析中,ADAM10是用吉西他滨辅助化疗治疗的胰腺癌患者总体生存率差和无病生存率低的独立预后因素。结论:胰腺癌中ADAM10蛋白的表达与患者接受吉西他滨辅助化疗的敏感性呈显著负相关。第二部分胰腺癌吉西他滨耐药株的建立与体外研究目的:本研究旨在建立胰腺癌吉西他滨耐药的体外模型,作为研究ADAM10调节胰腺癌吉西他滨敏感性机制的工具。方法:采用吉西他滨浓度递增培养法,建立人胰腺癌细胞系PANC-1细胞的吉西他滨耐药株。通过MTT法测量细胞的存活率,实时无标记细胞分析仪检测细胞生长曲线,Western blot检测耐药相关基因MDR1蛋白以及ADAM10的表达。ELISA检测PANC-1-GR及其亲本细胞株分泌NKG2D配体可溶型蛋白(sMICA/B、sULBP1-3)水平。MTT法检测NK细胞对PANC-1-GR及其亲本细胞株的杀伤效率。通过siRNA基因沉默下调ADAM10表达后,检测细胞分泌可溶型蛋白及对NK细胞杀伤敏感性。结果:建立吉西他滨耐药株PANC-1-GR细胞,与PANC-1亲本细胞株相比较,PANC-1-GR细胞对吉西他滨耐药,PANC-1-GR细胞对吉西他滨的半抑制浓度(IC50)为56.2±2.16μg/ml,而其亲本细胞株PANC-1的IC50为0.0060.003μg/ml。耐药相关基因 MDR1(multidrugresistancel)在 PANC-1-GR细胞中的表达显著增加。PANC-1-GR细胞与亲本株相比,增殖速度有所下降。PANC-1-GR细胞较PANC-1细胞高表达ADAM10,且细胞上清中见分泌MICA和ULBP2可溶型蛋白。PANC-1-GR细胞对NK细胞杀伤敏感性降低。对ADAM10进行RNA干扰使其表达下调,能够恢复PANC-1-GR细胞对NK细胞杀伤的敏感性。结论:建立的PANC-1-GR株具有吉西他滨耐药性,且高表达MDR1和ADAM10蛋白。ADAM10通过剪切分泌MICA和ULBP2可溶型蛋白,竞争结合NKG2D活化受体,导致PANC-1-GR细胞对NK细胞杀伤发生逃逸。第三部分ADAM10调节胰腺癌吉西他滨敏感性的上游机制研究目的:本研究旨在寻找ADAM10调节胰腺癌吉西他滨敏感性的上游机制,尤其是环状RNA-miRNA机制,以期寻找预测吉西他滨敏感性的血浆标志物。方法:采用环状RNA测序检测胰腺癌细胞PANC-1和其吉西他滨耐药株PANC-1-GR的差异circRNA谱。Q-PCR验证并筛选与吉西他滨敏感性密切相关的两种环状RNA。通过生物信息学分析,建立circRNA-miRNA结合网络图,筛选可能参与胰腺癌吉西他滨敏感性调节的miRNA。PANC-1细胞中过表达miR-145后,定量PCR检测金属蛋白酶的表达。结果:环状RNA测序发现126中差异表达circRNA,其中68个circRNA在PANC-1-GR细胞中上调,58个circRNA下调。定量PCR验证出两个差异明显的circRNA在PANC-1-GR细胞中表达上调,且该circRNA与患者对吉西他滨敏感性呈负相关。生物信息学分析发现miR145与两种circRNA均具有结合能力。过表达miR145能够抑制胰腺癌细胞中ADAM10和ADAM17的表达,且PDAC患者血浆中miR145的表达与其对吉西他滨的反应性呈正相关。结论:chr14:101402109-101464448+和 chr4:52729603-52780244+ 这两种环状RNA通过对miR145-5p的ceRNA机制,调节了金属蛋白酶ADAM10和ADAM17的表达,从而参与了对胰腺癌吉西他滨敏感性的免疫调控。
【图文】：

免疫组化,相关性

图２免疫组化结果判断ＭＶＤ和ＡＤＡＭ１０之间的相关性逡逑

吉西他滨,免疫组织化学染色,阴性

为进一步证实ｍｉＲ－１４５参与吉西他滨敏感性的调节，我们对接受吉西他滨治逡逑疗的ＰＤＡＣ患者血浆进行定量ＰＣＲ检测ｍｉＲ－１４５－５ｐ的表达，发现ｍｉＲ－１４５－５ｐ在逡逑吉西他滨无反应组的表达水平低于吉西他滨有反应组（图１７）。逡逑４讨论逡逑鉴于ｍｉＲＮＡ在胰腺癌吉西他滨耐药过程中发挥的重要作用，而ｃｉｒｃＲＮＡｓ可逡逑能通过与ｍｉＲＮＡｓ相互作用参与吉西他滨耐药，我们在这项研宄中，比较了邋ＰＡＮＣ－１逡逑和ＰＡＮＣ－１－ＧＲ细胞之间ｃｉｒｃＲＮＡｓ表达谱的差异。通过对筛选出的两个与吉西他逡逑滨反应性显著相关的两个邋ｃｉｒｃＲＮＡ（邋ｃｈｒｌ４：邋１０１４０２１０９－１０１４６４４４８＋和邋ｃｈｒ４：逡逑５２７２９６０３－５２７８０２４４＋）进行ｃｉｒｃＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ相互作用网络分析，，发现二者均与逡逑ｍｉＲ－１４５具有结合能力。结合文献报道的ｍｉＲ－１４５调节多种金属蛋白酶的表达，我逡逑们推测ｃｉｒｃＲＮＡｓ通过ｍｉＲ１４５－５ｐ－ＡＤＡＭ１０通路调节了胰腺癌细胞的免疫调控及逡逑对吉西他滨敏感性调节。逡逑５结论逡逑１，通过ｃｉｒｃＲＮＡ测序，分析了邋ＰＡＮＣ－１－ＧＲ细胞及其亲本细胞株的差异ｃｉｒｃＲＮＡ，逡逑并选择差异最显著的十个ｃｉｒｃＲＮＡ进行ＰＣＲ验证。逡逑２，通过对接受吉西他滨化疗的ＰＤＡＣ患者的血浆进行ｑＲＴ－ＰＣＲ分析，发现逡逑ｃｈｒ１４：１０１４０２１０９－１０１４６４４４８＋，ｃｈｒ４：５２７２９６０３－５２７８０２４４＋与患者对吉西他滨的反逡逑应性呈负相关。逡逑３
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9

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