miR-28-3P对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制研究

发布时间：2020-05-05 17:57

【摘要】：一、研究背景:胃癌是我国最常见的消化道肿瘤之一。2008年胃癌发病率居全球第4位,死亡率居第2位。其中,复发和远处转移是导致死亡的主要原因[1,2]。所以,探讨胃癌复发和迁移侵袭能力增加的分子生物学机制,对胃癌的诊断治疗和预防至关重要。miR-28与人类的多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[3-19]。而miR-28-3P与肿瘤的相关性,文献报道很少,生物信息学分析显示,PTEN可能是miR-28-3P的靶基因,它可以阻止PI3K的活化,进而抑制AKT的磷酸化来达到阻断肿瘤细胞失控性增殖的目的[20]。目前,miR-28-3P与胃癌的关系并不清楚,miR-28-3P与PTEN及PI3K/AKT通路之间的关系,也不清楚,如果本研究明确miR-28-3P在胃癌中的作用及机制,将为胃癌的靶向治疗提供重要的理论基础和新的治疗靶点。二、研究目的通过探讨miR-28-3P与胃癌的临床病理特点之间的关系以及它在胃癌的增殖、迁移侵袭中的主要作用及机制,为胃癌的早期诊断和治疗提供重要的理论基础。三、研究方法1.采用Q-RT-PCR和western blot的实验方法检测胃癌患者miR-28-3P的表达情况;2.shmiR-28-3P慢病毒转染胃癌细胞系,进行CCK8细胞增殖实验,平板克隆实验以及细胞迁移侵袭实验、划痕实验等,体外检测miR-28-3P对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。3.裸鼠皮下成瘤实验体内检测miR-28-3P对胃癌细胞增殖、凋亡以及皮下成瘤能力的影响,并进行免疫组化实验和HE来验证细胞恶性行为的变化及移植瘤血管生成情况。4.荧光素酶报告和生物信息学分析及功能回复实验来探讨miR-28-3P在胃癌细胞中的具体的作用靶点及其作用机制。四、实验结果1.miR-28-3P在胃癌组织及细胞系中呈高表达状况;2.shmiR-28-3P慢病毒转染胃癌细胞后,细胞的增值能力下降,抑凋亡蛋白Bcl2的表达量下降,凋亡蛋白Caspase3的表达量增加;胃癌细胞的迁移侵袭能力和划痕愈合能力明显下降,与迁移侵袭相关的蛋白MMP的表达也明显下降;3.裸鼠成瘤实验表明抑制了 miR-28-3P以后,胃癌细胞的裸鼠成瘤能力下降,移植瘤体积缩小;组织的异型性下降,和肿瘤微血管形成明显相关的基因CD31在免疫组化中呈现出低表达;4.抑制miR-28-3P的表达后,荧光素酶报告实验及功能回复实验显示PTEN基因是miR-28-3P下游作用的靶基因;抑制miR-28-3P的表达后,胃癌细胞株中PI3K/AKT呈现低表达的现象,证明了 miR-28-3P可能是通过抑制PTEN来激活PI3K/AKT通路,促进胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的。五、结论miR-28-3P在胃癌组织和多种胃癌细胞株中呈现高水平表达。miR-28-3P的高表达会促进细胞的增殖、迁移侵袭及恶性转化。抑制胃癌细胞株中miR-28-3P的表达,可以促进其靶基因PTEN的表达,抑制PI3K/AKT通路的激活,从而抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。而这一作用可能是通过调节miR-28-3P—PTEN—PI3K/AKT通路来实现的。
【图文】：

胃癌细胞株,转染,转染效率,荧光显微镜

转染细胞在培养箱中温育６小时。吸弃转染液，用Ｄ－Ｈａｎｋ’ｓ邋Ｓｏｌｕｔｉｏｎ漂洗逡逑后，转染ＮＣ－ＦＡＭ的细胞加入１５０４培养基，荧光显微镜下观察细胞转染结果。逡逑由图２．２可见：随着转染浓度的增加转染效率也是逐渐增加的。但是１０ｐｍｏｌ的慢逡逑病毒和２０ｐｍｏｌ的慢病毒之间的转染效率差异不是很显著，所以我们选定１０ｐｍｏｌ逡逑的浓度作为转染浓度。在荧光显微镜下，，我们观察到感染阳性的细胞达（５６±３．２）逡逑％。逡逑３８逡逑

序列,慢病毒,转染,胃癌细胞株

２．３转染效率的ＰＣＲ－ＲＮＡ验证逡逑运用ＰＣＲ技术验证ｓｈｍｉＲ－２８－３Ｐ干扰序列慢病毒下调ｍｉＲ－２８－３Ｐ的表达情逡逑况（如图２．３），结果显示，ｍｉＲ－２８－３Ｐ在经过慢病毒的转染以后，确实出现了明逡逑显的下调，差异有统计学意义。逡逑３９逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

【参考文献】