CD133及ALDH在肿瘤侵袭中的作用及机制研究

发布时间：2017-03-24 13:07

  本文关键词：CD133及ALDH在肿瘤侵袭中的作用及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分：CD133对直结肠癌侵袭能力的作用研究及机制探讨 CD133(prominin-1)是目前文献中使用率较高的干细胞表面标记分子。CD133在直结肠癌细胞中广泛表达,但其分子本身在结肠癌侵袭转移中的作用及机制未见报道。因此本研究重点观察了CD133在结肠癌体外侵袭中的作用,并深入探讨了其导致细胞侵袭能力改变的分子机制。 为筛选适宜的细胞模型,我们用流式细胞术及Western blotting检测了CD133在六种结肠癌中的表达,结果CD133阳性比例在不同细胞中跨度很大,从1.5%-98%不等。接着我们以恶性程度较高且CD133+率较高(83.52%)的HCT116细胞为模型,分选出CD133high及CD133low细胞进行体外培养及功能研究。结果发现CD133high细胞比CD133iow具有更强的增殖能力(集落形成、MTT检测)与侵袭能力(transwell检测),表明高表达干细胞标记CD133的肿瘤细胞在侵袭转移中发挥更重要的作用。 为研究CD133分子本身功能,我们用siRNA在体外有效敲低了HCT116田胞中CD133的表达,发现下调CD133可明显降低细胞的侵袭能力,但对癌细胞的增殖能力没有明显影响。至于CD133影响结肠癌肿瘤侵袭能力的分子机制,文献中未见相关报道。所以我们检测了与肿瘤侵袭转移密切相关的多个信号通路上的重要分子包括Hif-1α、Hif-1β、cdc42、RhoA、Smad7、TIMP-1和TIMP-2,结果表明敲低CD133仅显著下调了TIMP-2的表达。进一步用siRNA在体外有效敲低了TIMP-2的表达,发现敲低TIMP-2对细胞增殖及侵袭能力的影响与CD133敲低作用一致。首次证明TIMP-2是CD133的下游分子并且CD133通过TIMP-2影响癌细胞的侵袭能力。研究同时发现CD133及TIMP-2对HCT116细胞侵袭能力的影响与MMP2及MEK/ERK信号通路无关。 总之,我们的研究首次揭示了干细胞标记CD133分子本身在结肠癌侵袭过程中发挥重要作用,并且CD133是通过调节TIMP-2而影响癌细胞的侵袭能力。 第二部分ALDH对肿瘤细胞生物学行为的影响 乙醛脱氢酶(ALDH)是存在于细胞内依赖于NAD(P)+的酶,可将醛解毒为相应的酸。作为近年来新发现的肿瘤干细胞标记分子,ALDH已被证实可在多种正常组织及肿瘤组织中作为干细胞的标记分子。ALDH家族在人类细胞中有19个亚型,除ALDH1A1以外其他各亚型在肿瘤中的功能研究还较少,各亚型在不同肿瘤组织中的表达情况也比较复杂。有研究表明ALDH1A3在乳腺癌及黑色素瘤中有重要作用,而其在结肠癌及肺癌中的功能却未见报道。 本研究中我们首先用ALDEFLUOR法检测了ALDH在六种结肠癌及两种肺癌细胞系中的活性,发现在结肠癌细胞系中的表达情况差异很大,ALDH+细胞比例从7.4-64.5%不等,两种肺癌细胞系中A549与NCl-H157中ALDH+细胞比例分别为11.9%和1.2%。然后我们以结肠癌HCT116及肺癌A549田胞作为研究模型,用流式细胞术分选出了其中ALDHhigh及ALDHlow细胞进行功能研究,发现ALDHhigh细胞比ALDHlow细胞具有更强的体外增殖能力(MTT、集落形成),并且在HCT116细胞中ALDHhigh细胞比ALDHlow细胞具有更强的体外侵袭能力(transwell检测),说明ALDHhigh细胞具有干细胞的特性。将分选后的HCT116ALDHhigh细胞及ALDHlow细胞体外再培养,发现随着培养时间的延长ALDHhigh细胞中ALDH+细胞的比例呈下降趋势,而ALDHlow细胞中ALDH+细胞的比例呈上升趋势,并最终趋于HCT116细胞中ALDH+田胞的比例,说明肿瘤干细胞可能是一种功能状态(functional status)而不是特殊类型(special entity)。 由于两种细胞表达不同的ALDH亚型,HCT116主要是ALDH1A3,而A549细胞中同时表达ALDH1A1及ALDH1A3,需要探讨不同亚型对肿瘤细胞的影响。为此用siRNA将这两种亚型的表达进行了有效敲低并进行相关功能研究。结果显示,敲低ALDH1A3后,HCT116和A549细胞的侵袭能力均显著降低,A549细胞的增殖能力也显著降低,而HCT116细胞的增殖能力无显著变化,其机理还在深入研究中。说明ALDH1A3对肿瘤的增殖及侵袭转移能力具有重要影响。肿瘤细胞在病人体内处于低氧环境,为此我们利用在培养体系中加入CoCl2的方法来模拟低氧环境,发现下调ALDH1A3后的HCT116细胞在低氧环境中的凋亡比例增加,表明ALDH1A3与癌细胞的耐低氧能力有关,下调ALDH1A3降低了HCT116细胞对低氧环境的耐受。 总之,我们的研究首次揭示了ALDH尤其是其亚型ALDH1A3对结肠癌及肺癌细胞的生物学行为具有重要影响,为临床结肠癌及肺癌治疗提供了新的潜在靶点。 第三部分：小鼠树突状细胞肉瘤中SRS19-6MuLV病毒的检测及致病机理研究 SRS19—6MuLV是小鼠白血病病毒(MuLV)家族成员,分离于我国TSZ系统的白血病,与国外分离的只能引起单一白血病的小鼠白血病病毒不同,该病毒能引起至少4种白血病包括：红细胞性白血病,髓系白血病,T淋巴瘤及B淋巴瘤。我们实验室用以前工作中制备的抗小鼠树突状肉瘤(DCS)细胞的单克隆抗体983D4筛选DCS的cDNA表达文库,所获得的DNA序列经测序与小鼠白血病病毒SRS19-6MuLV高度同源。 为探讨SRS19-6MuLV是否可引起树突状肉瘤细胞,即是否是DCS肿瘤发生的病毒病因,我们首先用PCR检测了SRS19-6MuLV基因特异性片段在多种肿瘤细胞及组织中的存在情况,包括DCS细胞、15种小鼠肿瘤细胞、2种小鼠瘤株、12种小鼠正常组织、11种人肿瘤细胞及SRSV/3T3细胞(SRS19-6MuLV转化的阳性对照细胞)。结果显示,在DCS细胞、DCS的瘤株LⅡ及SRSV/3T3细胞基因组中存在SRS19-6MuLV特异基因片段,提示DCS细胞基因组中存在SRS19-6MuLV的插入。我们接着用反向PCR法(IPCR,从病毒插入片段设计引物,向病毒插入位点以外扩增)检测了SRS19-6MuLV在DCS及SRSV/3T3细胞基因组中的插入位点,找到7个病毒基因的插入位点。通过生物信息学分析,在插入位点周围发现了一些与肿瘤发生密切相关的普通脆性位点及Ras相关的miRNA。提示SRS19-6MuLV是DCS肿瘤发生的病毒病因。 SRS19-6MuLV不仅能引起四种白血病,我们的结果还证明SRS19-6MuLV也可以引起小鼠树突状细胞肉瘤(DCS),而此病毒并不感染人类细胞,丰富了我们对SRS19-6MuLV致瘤谱及致瘤机理的认识。
【关键词】：肿瘤 肿瘤干细胞 结直肠癌 CD133 ALDH 肺癌 DCS SRS19-6MuLV
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R730.23
【目录】：

• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 第一部分 CD133对结直肠癌侵袭能力的作用研究及机制探讨13-56
• 引言14-17
• 实验材料17-22
• 实验方法22-36
• 1. 细胞培养22
• 2. 细胞总蛋白的提取22
• 3. BCA法检测蛋白浓度22-23
• 4. Real Time PCR23-26
• 5. Western Blotting26-27
• 6. 细胞CD133~+率分析及CD133~(high)、CD133~(low)分选27-28
• 7. MTT法检测细胞增殖28
• 8. 细胞集落形成率测定28
• 9. Transwell体外侵袭实验28-29
• 10. siRNA干扰CD133或TIMP2的表达29-30
• 11. MMP2明胶酶谱检测30-31
• 12. 质粒转化、扩增31
• 13. CD133 shRNA表达载体构建31-34
• 14. 慢病毒包装34
• 15. 慢病毒感染目的细胞及稳定细胞株筛选34-35
• 16. 统计学方法35-36
• 实验结果36-50
• 1. CD133在六种结直肠癌细胞系中的表达36-37
• 1.1 流式细胞术检测CD133在六种结肠癌细胞系中的表达情况36
• 1.2 Western blotting检测CD133在六种结肠癌细胞系中的表达情况36-37
• 2. CD133~(high)亚群比CD133~(low)亚群具有更高的体外增殖能力与侵袭能力37-39
• 2.1 流式细胞术分选CD133~(high)与CD133~(low)细胞并检测分选纯度37
• 2.2 CD133~(high)亚群比CD133~(low)亚群具有更高的体外增殖能力37-38
• 2.3 CD133~(high)亚群比CD133~(low)亚群具有更强的集落形成能力38
• 2.4 CD133~(high)比CD133~(low)亚群具有更强的体外侵袭能力38-39
• 3. siRNA下调CD133后降低了HCT116细胞的侵袭能力39-41
• 3.1 siRNA可有效下调HCT116细胞中CD133的表达39-40
• 3.2 siRNA下调CD133后对HCT116细胞增殖能力没有影响40-41
• 3.3 siRNA下调CD133后降低了HCT116细胞的体外侵袭能力41
• 4. CD133的下调影响TIMP-2的表达41-44
• 4.1 侵袭转移相关信号通路分子筛查41-42
• 4.2 敲低CD133可使TIMP-2表达明显降低42-43
• 4.3 TIMP-2在CD133~(high)及CD133~(low)HCT116细胞中的表达没有区别43
• 4.4 敲低CD133对MMP及TIMP家族其他成员的影响43-44
• 5. siRNA下调TIMP-2后对CD133表达无影响且可以降低细胞的体外侵袭能力44-47
• 5.1 siRNA可以有效下调TIMP-2的表达44-45
• 5.2 siRNA下调TIMP-2后对CD133表达没有影响45-46
• 5.3 siRNA下调TIMP-2后对细胞的体外增殖能力没有影响46
• 5.4 siRNA下调TIMP-2后可降低细胞的体外侵袭能力46-47
• 6. MMP2及MEK/ERK通路不参与CD133及TIMP-2对细胞的影响47-48
• 7. CD133 shRNA表达载体的构建及CD133稳定敲低细胞系的建立48-50
• 讨论50-55
• 小结55-56
• 第二部分：ALDH对肿瘤细胞生物学特性的作用研究56-90
• 引言57-59
• 实验材料59-63
• 实验方法63-72
• 1. 细胞培养63
• 2. 细胞总蛋白的提取63
• 3. BCA法检测蛋白浓度63-64
• 4. Real Time PCR64-66
• 5. Western Blotting66-67
• 6. 细胞ALDH~+率分析及ALDH~(high)、ALDH~(low)分选67-68
• 7. MTT法及CCK8检测细胞增殖68-69
• 8. 细胞集落形成率测定69
• 9. Transwell体外侵袭实验69-70
• 10. siRNA干扰ALDH1A1或ALDH1A3的表达70
• 11. 细胞免疫化学染色70-71
• 12. 流式检测细胞周期71
• 13. 细胞凋亡检测71
• 14. 统计学方法71-72
• 实验结果72-85
• 1. 流式检测ALDH在几种结肠癌及肺癌细胞系中的表达72-73
• 2. ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞的生物学特点73-76
• 2.1 HCT116/A549细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞的分选73
• 2.2 HCT116/A549细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞的体外生长的差别73-74
• 2.3 HCT116细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞的集落形成能力差别74
• 2.4 HCT116细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞周期的差别74-75
• 2.5 HCT116细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞再培养75
• 2.6 HCT116细胞中ALDH~(high)与ALDH~(low)细胞的体外侵袭能力的观察75-76
• 3. ALDH1A1及ALDH1A3在几种结肠癌细胞中的表达情况76-78
• 3.1 Western boltting检测ALDH1A1及ALDH1A3在几种结肠癌及肺癌细胞系中的表达情况76-77
• 3.2 间接免疫荧光检测ALDH1A1及ALDH1A3在HCT116/A549细胞中的表达情况77-78
• 4. siRNA下调ALDH1A1及ALDH1A3对HCT116/A549细胞的影响78-85
• 4.1 siRNA可有效下调ALDH1A1及ALDH1A3的表达78
• 4.2 siRNA下调ALDH1A3或ALDH1A1后对HCT116/A549中ALDH~+细胞比例的影响78-79
• 4.3 siRNA下调ALDH1A1及ALDH1A3后对HCT116/A549细胞凋亡没有影响79-80
• 4.4 siRNA下调ALDH1A3后对HCT116增殖能力没有影响80-81
• 4.5 siRNA下调ALDH1A1及ALDH1A3后对A549的增殖能力有不同影响81
• 4.6 siRNA下调ALDH1A3后对A549细胞周期的影响81
• 4.7 siRNA下调ALDH1A3后能降低HCT116的体外侵袭能力81-82
• 4.8 siRNA下调ALDH1A3后能降低A549的体外侵袭能力82-83
• 4.9 siRNA下调ALDH1A3后能降低HCT116细胞对CoCL_2模拟的低氧环境的耐受83-85
• 讨论85-89
• 小结89-90
• 第三部分：小鼠树突状细胞肉瘤中SRS19-6MULV病毒的检测及致病机理研究90-106
• 引言91-92
• 实验材料92-94
• 实验方法94-98
• 1. 细胞培养94
• 2. 培养细胞及组织基因组DNA提取94-95
• 3. PCR扩增目的片段95
• 4. PCR产物胶回收95-96
• 5. 透射电镜检测DCS及SRSV/3T3细胞中有无病毒颗粒96
• 6. IPCR方法检测SRS19-6MuLV病毒在DCS及SRSV/3T3基因组中的插入位点96-97
• 7. 序列及插入位点生物信息学分析97-98
• 实验结果98-103
• 1. DCS及其他小鼠肿瘤细胞中SRS19-6MuLV病毒的检测结果98
• 2. 小鼠正常组织、细胞中SRS19-6MuLV病毒的检测结果98-99
• 3. 小鼠瘤株及SRSV/3T3细胞中SRS19-6MuLV病毒的检测结果99-100
• 4. 人肿瘤细胞中SRS19-6MuLV病毒的检测结果100
• 5. 透射电镜检测病毒颗粒100-101
• 6. SRS19-6MuLV病毒在DCS细胞及SRSV/3T3细胞中插入位点101
• 7. 序列及插入位点生物信息学分析101-103
• 讨论103-105
• 小结105-106
• 参考文献106-114
• 缩略语114-116
• 文献综述116-132
• 参考文献126-132
• 附录：已发表文章132-134
• 致谢134-135
• 个人简历135-136

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 李存玺,顾蓓,高进;小鼠树突状细胞肉瘤细胞系的建立及形态学鉴定[J];解剖学报;1997年01期

2 段德义,刘玉琴,高进,顾蓓,赵雪梅;DCS细胞中SRS19-6白血病病毒3’-cDNA序列的克隆[J];中国免疫学杂志;2001年01期

  本文关键词：CD133及ALDH在肿瘤侵袭中的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：265635