【摘要】：食管癌(esophageal cancer,EC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤。EC主要包括两种组织学亚型:食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,ECA)。ESCC作为最常见的组织学类型主要发生在非洲、伊朗和中国北部地区。尽管目前在治疗策略上有显著的进展,但ESCC病人的5年生存率仍然很低。目前,化疗仍是食管鳞癌患者最有效的治疗手段,然而耐药性及其产生的毒性是导致其治疗失败的主要原因。因此,阐明食管鳞癌耐药的分子机制以及寻找新的诊断和预后判定的分子标记具有十分重要的意义。微小RNA(miRNAs或miRs)是一类小的非编码RNA分子,由19-25个核苷酸组成,能通过靶向特定的基因调控机体内基因的表达。大量的证据表明,miRNAs牵涉到多种不同的细胞生物学过程,包括细胞凋亡、细胞周期、细胞侵袭和转移、信号途径的调控以及耐药等。最为重要是,miRNAs通过调控多种不同的靶基因参与肿瘤的起始、发展及进展过程,因而miRNAs在不同类型的肿瘤中可能发挥癌基因或抑癌基因的作用,并且一些miRNAs分子已经被证实作为肿瘤早期诊断的分子标记。因而阐明miRNAs在肿瘤发生、发展中的功能有望为肿瘤寻找新的分子靶点,具有十分重要的临床价值。微小RNA-125a-5p(miR-125a-5p)作为一种新近发现的miRNA分子,已经被证实参与许多肿瘤的发展和进展过程,包括:喉癌、肝癌、肺癌和前列腺癌。MiR-125a-5p在多种不同的肿瘤中发挥抑癌基因的作用。此外,miR-125a能提高紫杉醇抗性的结肠癌细胞对紫杉醇的敏感性,提示miR-125a可能成为肿瘤病人化疗的辅助药物。这些研究充分表明,miR-125a-5p可能在肿瘤诊断、治疗和预后中发挥重要作用。然而,目前miR-125a-5p在食管鳞癌发生、发展中的作用尚不清楚。因此在本研究中,我们首先探讨miR-125a-5p在食管鳞癌组织中的表达,分析其表达与食管鳞癌病人临床病理学参数和预后的关系。进一步从体外研究miR-125a-5p表达水平上调或下调对食管鳞癌细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭能力的影响,并分析上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达。最后将miR-125a-5p与顺铂联用,分析其对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,并采用双荧光素酶报告实验证实miR-125a-5p作用的靶基因,初步揭示其可能的分子机制。该研究为以miR-125a-5p为靶点的食管鳞癌病人的治疗及化疗奠定基础。第1章MicroRNA-125a-5p在食管鳞癌组织中的表达及其与预后的关系方法1.采用实时荧光定量PCR检测56例食管鳞癌组织和匹配的正常组织中miR-125a-5p的表达。2.统计学处理:实验数据均是来自3次独立重复的实验结果,数据表示为平均值±SD,采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析,二组之间比较采用t检验,三组及以上采用单因素方差分析。采用Kaplan-Meier制作生存曲线,利用Log-rank检验分析其差异。P0.05表示具有统计学差异。结果1.食管鳞癌组织中miR-125a-5p的表达水平显著低于正常组织,且具有统计学差异(P0.0001)。2.MiR-125a-5p在III+IV期的病人中的表达水平显著低于I+II期的病人的表达水平,且具有统计学差异(P0.01);miR-125a-5p在有淋巴结转移患者中的表达水平显著低于无淋巴结转移患者的表达水平,且具有统计学差异(P0.001)。3.MiR-125a-5p高表达的食管鳞癌患者的存活率显著高于低表达患者,且具有统计学差异(P0.05)。4.MiR-125a-5p表达水平与食管鳞癌患者的TNM分期、组织学分级和淋巴结转移密切相关(P0.05),但与患者的年龄和性别无关(P0.05)。5.Cox比例风险回归模型结果表明,临床分期、淋巴结转移和miR-125a-5p是食管鳞癌病人独立的预后因子。第2章MicroRNA-125a-5p对食管鳞癌细胞生物学行为的影响及其分子机制方法1.采用实时荧光定量PCR检测食管鳞癌细胞(Eca109、EC9706、EC1、TE1、KYSE450和KYSE70)和正常食管上皮细胞Het-1A中miR-125a-5p的表达。2.将阴性对照(negative control,NC)、miR-125a-5p类似物和抑制剂分别转染食管鳞癌EC1和TE1细胞,实验分为4组:对照组、NC组、miR-125a-5p类似物组和miR-125a-5p抑制剂组。3.采用CCK-8检测上述不同组别的食管鳞癌细胞在24h、48h、72h和96h的增殖情况,采用流式细胞术检测不同组别的食管鳞癌细胞周期和凋亡情况。4.采用划痕实验和Transwell小室分别检测不同组别的食管鳞癌细胞的迁移和侵袭能力的变化。5.采用Western blot检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达。6.统计学分析:实验数据采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析,实验数据均表示为,二组之间采用t检验,三组及以上采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P0.05表示差异具有显著性。结果1.食管鳞癌细胞(Eca109、EC9706、EC1、TE1、KYSE450和KYSE70)中miR-125a-5p的表达水平显著低于正常食管上皮细胞Het-1A,其中EC1和TE1其表达水平最低。2.与对照组和NC组相比,miR-125a-5p类似物组中食管鳞癌EC1和TE1细胞中miR-125a-5p的相对表达水平显著升高,且差异具有统计学意义(P0.05)。然而,miR-125a-5p抑制剂组中食管鳞癌EC1和TE1细胞中sx±miR-125a-5p的相对表达水平显著降低,且差异具有统计学意义(P0.05)。3.MiR-125a-5p类似物组中食管鳞癌EC1和TE1细胞的增殖能力低于对照组和NC组,且差异具有统计学意义(P0.05)。相反,miR-125a-5p抑制剂组中食管鳞癌EC1和TE1细胞的增殖能力显著加强,且差异具有统计学意义(P0.05)。4.与对照组和NC组相比,miR-125a-5p类似物组中食管鳞癌EC1和TE1细胞在G0/G1期的细胞数显著增加,而在S期的细胞数显著降低,且差异具有统计学意义(P0.05)。相反,miR-125a-5p抑制剂组中食管鳞癌EC1和TE1细胞在G0/G1期的细胞数显著降低,而在S期的细胞数显著增加,且差异具有统计学意义(P0.05)。5.与对照组和NC组相比,miR-125a-5p类似物组中食管鳞癌EC1和TE1凋亡的细胞数显著增加,且具有统计学差异(P0.0001)。相反,miR-125a-5p抑制剂组中食管鳞癌EC1和TE1凋亡的细胞数显著降低,且差异具有统计学意义(P0.05)。6.与对照组和NC组相比,miR-125a-5p类似物组中食管鳞癌EC1和TE1在12h和24h细胞的迁移能力显著被抑制,且差异具有统计学意义(P0.05)。但当转染miR-125a-5p抑制剂时,其在12h和24h食管鳞癌细胞EC1和TE1的迁移能力明显强于对照组和NC组,且差异具有统计学意义(P0.05)。7.与对照组和NC组相比,食管鳞癌EC1和TE1细胞转染miR-125a-5p类似物后细胞的侵袭能力显著降低,且差异具有统计学意义(P0.05)。然而,当利用miR-125a-5p抑制剂进行转染后,细胞的侵袭能力显著高于对照组和NC组,且差异具有统计学意义(P0.05)。8.与对照组和NC组相比,miR-125a-5p类似物组中E-cadherin的表达显著上调,而N-cadherin和Vimentin的表达显著下调,且差异具有统计学意义(P0.05)。然而,当转染miR-125a-5p抑制剂时,与对照组和NC组相比,E-cadherin的表达显著下调,而N-cadherin和Vimentin的表达显著上调,且差异具有统计学意义(P0.05)。第3章MicroRNA-125a-5p增加顺铂对食管鳞癌细胞的敏感性及其分子机制方法1.采用CCK-8检测顺铂联合NC或miR-125a-5p类似物后食管鳞癌EC1和TE1细胞在24h细胞的增殖情况。采用流式细胞术、细胞划痕实验和Transwell小室分别检测NC组、单独miR-125a-5p类似物组、单独顺铂组以及miR-125a-5p类似物和顺铂联合组中食管鳞癌EC1和TE1细胞凋亡、细胞迁移和细胞侵袭能力的变化。2.采用Western blot检测NC组、单独miR-125a-5p类似物组、单独顺铂组以及miR-125a-5p类似物和顺铂联合组中食管鳞癌EC1和TE1细胞上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达的变化。3.利用在线软件TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和miRDB(http://www.mirdb.org/)搜索miR-125a-5p可能作用的靶基因。双荧光素酶报告实验证实miR-125a-5p直接作用的靶基因。Western blot检测对照组、NC组和miR-125a-5p类似物组中t-STAT3、p-STAT3和VEGF蛋白的表达以及NC组、单独miR-125a-5p类似物组、单独顺铂组以及miR-125a-5p类似物和顺铂联合组中食管鳞癌EC1和TE1细胞t-STAT3、p-STAT3和VEGF蛋白的表达。4.Western blot检测NC组、miR-125a-5p类似物和顺铂联合组以及miR-125a-5p/顺铂/IL-6组中t-STAT3、p-STAT3和VEGF蛋白的表达。5.CCK-8实验、流式细胞术以及Transwell小室分别用来检测NC组、miR-125a-5p类似物和顺铂联合组以及miR-125a-5p/顺铂/IL-6组食管鳞癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化。6.统计学分析:所有的实验数据采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析,实验数据均表示为,二组之间采用t检验,三组及以上采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P0.05表示差异具有显著性。结果1.与NC转染组相比,不同浓度的顺铂处理后,转染miR-125a-5p类似物的食管鳞癌EC1和TE1细胞的增殖能力均显著受到抑制。sx±2.单独的miR-125a-5p类似物和单独的顺铂处理后食管鳞癌EC1和TE1细胞的凋亡率显著高于NC组,且差异具有统计学意义(P0.05),然而当miR-125a-5p类似物和顺铂联用时,食管鳞癌EC1和TE1细胞凋亡的细胞数显著上升,且差异具有统计学意义(P0.05)。3.单独的miR-125a-5p类似物和单独的顺铂处理后食管鳞癌EC1和TE1细胞的迁移距离显著低于NC组,且差异具有统计学意义(P0.05),然而当miR-125a-5p类似物和顺铂联用时,食管鳞癌EC1和TE1细胞迁移的距离显著下降,且差异具有统计学意义(P0.01)。4.单独的miR-125a-5p类似物和单独的顺铂处理后食管鳞癌EC1和TE1细胞的侵袭的细胞数显著低于NC组,且差异具有统计学意义(P0.05),然而当miR-125a-5p类似物和顺铂联用时,食管鳞癌EC1和TE1细胞侵袭的数量显著下降,且差异具有统计学意义(P0.001)。5.单独的miR-125a-5p和单独的顺铂处理后,食管鳞癌EC1和TE1细胞中E-cadherin的表达显著上升,而N-cadherin和Vimentin的表达显著降低,与NC组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。最为显著的是,当miR-125a-5p与顺铂联用时,E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达的变化最为显著,与NC组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。6.与NC组相比,miR-125a-5p的转染能显著降低食管鳞癌EC1和TE1中转染野生型STAT3-3’UTR质粒的荧光素酶的活性,但不改变转染突变型STAT3-3’UTR质粒的荧光素酶的活性。与对照组和NC组相比,miR-125a-5p类似物转染后食管鳞癌EC1和TE1细胞中t-STAT3、p-STAT3及其下游基因VEGF蛋白的表达水平均显著被下调,且差异具有统计学意义(P0.05)。7.单独的miR-125a-5p和单独的顺铂均能显著下调食管鳞癌EC1和TE1细胞中t-STAT3、p-STAT3和VEGF蛋白的表达,与NC处理组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。最为显著的是,当miR-125a-5p和顺铂联用时,食管鳞癌EC1和TE1细胞中t-STAT3、p-STAT3和VEGF蛋白的表达水平下调最为显著,与NC处理组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。8.与NC组相比,miR-125a-5p联用顺铂组中t-STAT3、p-STAT3和VEGF蛋白的表达显著下调,且差异具有统计学意义(P0.05),但与miR-125a-5p联用顺铂组相比,miR-125a-5p/顺铂/IL-6组中t-STAT3、p-STAT3和VEGF蛋白的表达显著上升,且差异具有统计学意义(P0.05)。9.与NC组相比,miR-125a-5p联用顺铂组中食管鳞癌EC1和TE1细胞增殖能力显著被抑制。然而,与miR-125a-5p联用顺铂组相比,miR-125a-5p/顺铂/IL-6组中食管鳞癌EC1和TE1细胞增殖能力显著提升。10.与NC组相比,miR-125a-5p联用顺铂组中食管鳞癌EC1和TE1凋亡的细胞数显著增多,且差异具有统计学意义(P0.05),然而,与miR-125a-5p联用顺铂组相比,miR-125a-5p/顺铂/IL-6组中食管鳞癌EC1和TE1凋亡的细胞数显著降低,且差异具有统计学意义(P0.05)。11.与NC组相比,miR-125a-5p联用顺铂组中食管鳞癌EC1和TE1细胞的侵袭能力被显著抑制,且差异具有统计学意义(P0.05),然而,与miR-125a-5p联用顺铂组相比,miR-125a-5p/顺铂/IL-6组中食管鳞癌EC1和TE1细胞的侵袭能力明显得到恢复,且差异具有统计学意义(P0.05)。结论(1)MiR-125a-5p在食管鳞癌中的低表达与食管鳞癌的发生发展密切相关,可能成为食管鳞癌病人临床分期、转移和预后判定重要的分子标记。临床分期、淋巴结转移和miR-125a-5p是食管鳞癌病人独立的预后因子。(2)miR-125a-5p表达的变化显著改变肿瘤相关的生物学特征如增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭,这可能与EMT相关信号途径的改变密切相关。(3)MiR-125a-5p显著增加顺铂对食管鳞癌细胞的抑制作用、细胞凋亡、迁移和侵袭的抑制作用,这与EMT信号途径的抑制关系密切。(4)STAT3是miR-125a-5p直接的靶基因,miR-125a-5p联用顺铂显著失活STAT3信号途径。IL-6能逆转miR-125a-5p联用顺铂引发的STAT3信号途径的失活,IL-6引发的STAT3的再活化显著促进细胞增殖,抑制凋亡和促进侵袭。
【图文】：
27图 2.2 miR-125a-5p 在不同处理组的食管鳞癌 EC1 和 TE1 细胞中相对表达水平 2.2 The relative expression level of miR-125a-5p in EC1 and TE1 cells in different treating gA 图：不同处理组的食管鳞癌 EC1 细胞中 miR-125a-5p 的相对表达水平*p<0.05 和 **p<0.01，与对照组和 NC 组相比B 图：不同处理组的食管鳞癌 TE1 细胞中 miR-125a-5p 的相对表达水平*p<0.05，与对照组和 NC 组相比iR-125a-5p 对食管鳞癌细胞增殖的影响了分析 miR-125a-5p 在食管鳞癌细胞增殖中的作用，我们将 miR和抑制剂转染食管鳞癌 EC1 和 TE1 细胞，采用 CCK-8 检测不同处
第 2 章 MicroRNA-125a-5p 对食管鳞癌细胞生物学行为的影响及其分子机制癌细胞增殖能力的变化。结果表明，与对照组和 NC 组相比，miR-1组中食管鳞癌 EC1 和 TE1 细胞的增殖被显著抑制，且差异具有统<0.05）（图 2.3）。相反，miR-125a-5p 抑制剂组中食管鳞癌 EC1 和 殖能力显著加强，且差异具有统计学意义（P<0.05）（图 2.3）。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1
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2658465
