b-AP15克服慢粒细胞白血病对伊马替尼耐药的体内外研究

发布时间：2020-05-11 20:02

【摘要】：研究背景及目的慢性粒细胞性白血病(CML),简称慢粒,与造血干细胞的染色体异常有关,最典型的是费城染色体长臂上9号染色体与22号染色体的易位,这种易位导致BCR-ABL融合基因的产生,同时产生大量的BCR-ABL融合蛋白,同时酪氨酸激酶被异常激活。BCR-ABL可以改变骨髓祖细胞,并且驱动95%慢性粒性细胞白血病(CML)病例的发展。BCR-ABL通过激活能够提高细胞增殖和生存的下游通路来促进慢性粒细胞白血病的发展,这些通路包括RAF/MEK/ERK、PI3K/AKT、JAK/STAT等。慢粒的临床分期是:慢性期、加速期、急变期。伊马替尼作为CML和其他表达BCR-ABL的白血病的一线临床用药,它可以与ABL激酶位点结合,进而抑制其底物磷酸化,大部分病人用伊马替尼治疗后,他们在疾病的慢性阶段获得了完整的细胞遗传学反应。然而,在使用伊马替尼治疗病人的分子研究结果表明:仍可检测到BCR-ABL高表达;并且停用伊马替尼治疗后,疾病很容易复发。使用伊马替尼治疗后常常存在许多不良反应,其中比较常见的副作用有肠道反应(恶心、呕吐、腹泻)、水肿、肌肉痉挛、皮疹。骨髓抑制,肝酶水平升高,特别是在慢性粒细胞白血病中,骨髓抑制更常见。伊马替尼作用的时间也很有限,研究还发现伊马替尼耐药可以出现在慢性粒细胞白血病的任何阶段。而伊马替尼耐药会导致疾病复发和病情恶化。伊马替尼耐药有多种机制,而BCR-ABL依赖型的慢性粒细胞白血病的耐药机制是由于ABL基因位点发生了突变(其中最主要的是T315I突变),最终使得伊马替尼不能成功地与ABL激酶位点结合,最终使得下游的通路异常活化。为了克服这种耐药,随后又研究出了第二代酪氨酸激酶抑制剂,最典型的是尼罗替尼、达沙替尼。与伊马替尼相比较,尼罗替尼更能有效地抑制野生型BCR-ABL细胞系和BCR-ABL突变细胞系的增值。同时,它更能减少白血病负担(二者的有效使用剂量都要比伊马替尼小),延长患者的生存期,但是对T315I点突变型确无效。但是与伊马替尼一样,使用尼罗替尼后会引起副作用:3到4级骨髓抑制,同时会引起胆红素和脂肪酶升高。达沙替尼,可以与丝氨酸/苏氨酸激酶(比如TCL家族激酶、促分裂原活化蛋白激酶、受体酪氨酸激酶)结合。达沙替尼能够有效地对抗伊马替尼耐药活性构象的问题(因为它与酪氨酸家族激酶有更好的亲和力)。和尼罗替尼一样,达沙替尼可以抑制大部分野生型和BCR-ABL突变细胞系的增值和激酶活力,但是对T315I位点突变体仍然无效。同时,它也有副作用,尤其是在疾病的急变期,容易引起3-4级骨髓抑制。最近获得批准的帕纳替尼,已经证明了对难治性的慢性粒细胞白血病患者有疗效,帕纳替尼是唯一一个能治疗伴T315I突变患者的酪氨酸激酶抑制剂。但是它的副作用也很明显,它与动脉高压(有时是严重的)和严重的动脉闭塞、静脉血栓栓塞事件的风险增加有关。酪氨酸的持续激活导致慢性粒细胞白血病出现了几种异常变化:改变细胞粘连,抑制细胞凋亡,抑制蛋白酶体降解,有丝分裂原下游通路信号异常激活。所以,如果从BCR-ABL下游通路着手,可能是一个很好的治疗方法。泛素蛋白酶体系统(UPS)对细胞内蛋白的降解有着严格的调控作用。主要包括信号转导,基因表达,细胞周期,复制,分化,免疫反应,细胞的应激反应等等。癌细胞的主要特征是失去了细胞周期的调控,癌细胞失去了DNA修复功能,同时获得的基因的高度突变。最后产生大量的、错误折叠的蛋白,而这些都是具有细胞毒性作用的物质。为了弥补这个严重的问题,癌细胞增强了蛋白酶体系统的高表达,从而消除这些蛋白(也就是说癌细胞的蛋白酶体系统比正常细胞的UPS更活跃)。与没有特异性的溶酶体降解相反的是,蛋白酶体对体内蛋白的降解具有高度的选择性,只有那些被小分子泛素标记过的蛋白方可被降解。泛素蛋白酶体降解蛋白是一个复杂的过程,该过程包括泛素,3种酶,蛋白酶体的参与。其中,泛素是一种具有76个赖氨酸残基的高度保守的蛋白,泛素与底物的赖氨酸结合成一个异肽键,即形成单泛素化底物,随后,底物可以被更多的泛素标记,形成多聚泛素化链。泛素分子有7个赖氨酸,但是与底物蛋白结合的是赖氨酸48号残基,最终导致靶蛋白的降解。泛素其他的残基则负责蛋白的入核出核、DNA修复、基因表达、信号转导、胞吞等作用。蛋白降解的第一步便是泛素与泛素活化酶E1链的形成,这个过程需要ATP水解供能。然后活化的泛素被转运到酶E2(泛素结合酶),复杂的E2酶激活泛素并与特定的E3(泛素连接酶)结合,并将泛素转运到相应的底物。最后一步,就是蛋白酶体降解的过程。蛋白酶体是一种蛋白水解物,细胞核和细胞质中都有。蛋白酶体由三部分组成,其中主要单元是位于中央的空柱状多酶核20S。20S由4个环组成,其中有2个相同的非催化亚基α环,2个催化亚基β环,一起形成了一个αββα结构,20S主要负责底物的降解。另外2个调节单元(19S),二者结构相同,位于20S的2端。19S由2部分组成:外部的是一个盖子,它负责识别被泛素标记的多聚泛素化底物,并对泛素进行移除。而19S的内部(基底部),通过6个ATP亚基的作用,负责相关底物的变性。在最后的降解过程中,白蛋白被19S识别并被19S移去多聚泛素链,然后被转入到20S水解中心,目的蛋白最后被其降解为10-12个氨基酸的短肽结构。被FAD批准的具有选择特异性的第一线蛋白酶体抑制剂是硼替佐米(PS-341)。它是一个以硼为双肽的结构,能够可逆地抑制20S上糜蛋白酶的活性,同时还能轻度抑制20S上半胱天冬蛋白酶活性(也就是说硼替佐米是一个20S蛋白酶体抑制剂)。从力学上来看,酸性物质硼替佐米与β亚基内部的亲核羟基侧链形成了共价结构。硼替佐米最初被批准用于初诊的多发性骨髓瘤,复发/难治性多发性骨髓瘤,套细胞淋巴瘤。硼替佐米抗肿瘤的机制多种多样,其中包括:抑制NF-κB信号通路、抑制抗凋亡靶基因,抑制几种抗凋亡蛋白(如Bcl-XL、bcl-2和STAT-3);下调DNA修复相关蛋白的表达,诱导内质网应激(ER)和促凋亡蛋白反应(UPR)。硼替佐米有很好的化疗作用,同时还可以克服传统的耐药问题,当其与其他药物合用的时候。尽管硼替佐米在血液恶性肿瘤中,取得了很好的治疗效果,但是许多病人在疾病好转后又很容易复发,同时,使用硼替佐米后存在许多细胞毒性(比如:神经毒性),并且还出现了耐药现象。这些因素就促使了研究这去寻找其他的蛋白酶体抑制剂:能够克服硼替佐米耐药、具有更好的性能、更小的细胞毒性、更广的抗癌反胃谱。继而研制出了第二代更好性能的硼替佐米衍生物:卡非佐米(Carfilzomib)。卡非佐米在2012年被FAD批准用于复发性和难治性多发性骨髓瘤。卡非佐米与β5亚基形成共价结构,从而抑制20S上糜蛋白活性。除了卡非佐米,其他的蛋白酶体抑制也正在临床试验的积极研究之中,比如Marizomib。Marizomib是一种天然乳胞素的衍生物。和硼替佐米及卡非佐米不同的是,Marizomib可以以不可逆的方式与蛋白酶体的三个亚基(β1,β2,和β5)结合,以更持久、更强的方式抑制糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性。值得一提的是,Marizomib可以克服多发性骨髓瘤及慢性淋巴瘤对硼替佐米的耐药。与硼替佐米相比,Marizomib的这一临床特性可能归功于其对诱导凋亡的Caspase-8有更强的特异性。19S为调节颗粒,它的作用是将靶蛋白上的泛素去除,然后将靶蛋白输送至20S核心颗粒中进行降解。如果蛋白的去泛素化过程被阻断,那么蛋白便不能被降解,因为20S核心颗粒上狭窄的通道不允许多聚长链的泛素蛋白进入催化部位。由此可见,去泛素化酶抑制剂可能会干扰蛋白酶体的活性。去泛素化酶在许多疾病(比如遗产癌症和神经退化病)发挥很重要的作用,这些酶参与DNA的损失应激、DNA的修复及转导等过程。去泛素化酶根据它们的结构可以分为2大类:金属蛋白酶和半胱蛋白酶。所有的金属蛋白酶(包括POH1)都含有相同的泛素-蛋白酶结构域JAMM。半胱蛋白酶又分为4类:USP、UCH、OTU、MJD。这两类酶的分类反应了它们对多聚泛素链的特异亲和性。其中,USP家族(比如USP14)特异性识别泛素自由羟基末端的两个甘氨酸。因此,USP14只能去除单个的泛素,而不能去除靶蛋白上的整条泛素链。另一方面,UCH37(它是UCH家族成员),能特异性识别底物上的二聚泛素。而POH1可以切除从未折叠蛋白酶体底物伸展开来的整条多聚泛素化链。深入研究表明,敲出POH1会干扰酶体的组装,而去除UCH37或者USP14仅仅影响蛋白底物的降解。这表明,在蛋白酶体降解蛋白的过程中,POH1酶对大多数的去泛素化至关重要,而UCH37和USP14则扮演更特殊的角色。然而双重敲除UCH37和USP14后,蛋白酶体的活性也会受到抑制,这也使得它们成为药物候选的对象。虽然还没有发现POH1的抑制剂,但是最却发现了UCHL5和USP4的小分子抑制剂:b-AP15。b-AP15最初是在小分子的筛选中被发现的,它可以诱导溶酶体引起的凋亡,而这一过程并不依赖于肿瘤抑制抑制因子p53。这个化合物可以抑制许多针对Ub-AMC底物的DUB活性,但是它并不影响20S水解蛋白中心的活性。体内实验研究表明,b-AP15可以影响肿瘤的进展。此外,b-AP15还可以抑制对伊马替尼耐药的多发性骨髓瘤细胞的增值,同时,它在多种实体瘤的治疗中也有很好的效果。正因为这个小分子抑制剂取得了如此良好的效果,并且其临床副作用也比较小,所以研究者期待进行更深层次的探究,看其是否能够治疗更多种的疾病,当然也期待其治疗疾病的机制。为此,我们课题的研究目的:探讨b-AP15在慢性粒细胞白血病伊马替尼敏感型和伊马替尼耐药型细胞中的作用,为b-AP15在CML中的应用提供理论基础。结果1.b-AP15降低Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突变型细胞的活力。2.b-AP15诱导Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突变型细胞凋亡。3.b-AP15诱导Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突变型细胞凋亡与caspase激活及抗凋亡蛋白表达下调相关。4.b-AP15通过抑制19S的去泛素化酶USP14和UCHL5的活性,抑制蛋白酶体功能,随后细胞发生死亡。5.b-AP15诱导的蛋白酶体抑制与内质网应激及细胞凋亡相关。6.b-AP15下调Bcr-Abl蛋白水平的表达,并抑制其下游信号通路。7.b-AP15抑制USP14蛋白水平,使β-catenin水平也下调,进而使Bcr-Abl减少,引起CML细胞死亡。8.b-AP15在慢性粒细胞白血病病人原发性单核细胞中,也能抑制细胞的活力,诱导细胞凋亡。9.b-AP15抑制Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突变型细胞裸鼠移植瘤的生长。结论1.b-AP15抑制Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突变型细胞的活力并诱导其凋亡。我们的研究证实b-AP15诱导这2类型细胞死亡是伴随于b-AP15对蛋白酶体的作用的,同时其诱导的细胞死亡也是caspase依赖的,19S蛋白酶体相关去泛素化酶在凋亡过程中起着关键作用。我们在这里提出了一种通过下调Bcr-Abl表达而克服伊马替尼耐药的非传统治疗方案,为慢性粒细胞白血病克服伊马替尼耐药的治疗提供重大的临床意义。2.b-AP15通过抑制USP14,使WNT通路中的β-catenin水平下调,进而使Bcr-Abl蛋白水平下降,最后引起细胞死亡。3.b-AP15对Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突变型两种类型的裸鼠移植瘤均有抑制作用。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.72

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