KDM5C在人肝癌细胞中功能的初步研究
发布时间：2020-05-12 02:25
【摘要】：原发性肝癌位于恶性肿瘤死亡率前列,具有发病率高,不易发现,病情发展迅速等特点,是现代分子细胞生物学,医学的研究热点。KDM5C(JARID1C or SMCX)属于组蛋白去甲基化酶家族,位于X染色体,含有一个ARID结构域,一个JmjC结构域,一个JmjN结构域和两个PHD型锌指的蛋白质,其中JmjC结构域主要发挥特异性去除H3K4me3的甲基残基的功能,而H3K4me3是一个重要的组蛋白修饰marker,可以影响其他基因的转录激活。本课题通过实时定量PCR检测了KDM5C在人肝癌及癌旁组织的表达,结果显示相对于癌旁组织,KDM5C在肝癌组织中的表达上调。苏木精伊红(HE)染色和免疫组化的结果显示,KDM5C基因在肝癌组织的细胞核和细胞质中均有表达,但主要集中于细胞核内。为研究KDM5C在肝癌细胞中的功能,本文利用CRISPR/Cas9对KDM5C进行了敲除并建立了稳定的细胞系。首先利用CRISPR/Cas9的靶点设计网站进行KDM5C敲除位点的设计选择,随后将构建好的靶点连入pX458载体,转染肝癌HepG2细胞,利用有限稀释法建立KDM5C敲除细胞系(KDM5C-KO)并通过测序和Western Blot进行了敲除验证。其次本论文研究了KDM5C对肝癌细胞生物学行为的影响。MTT增殖和克隆形成实验的结果显示,KDM5C敲除显著抑制了肝癌细胞HepG2的增殖和克隆形成;PI染色发现KDM5C敲除后,细胞S期比例下降,细胞增殖受到抑制;进一步研究发现KDM5C敲除促进了肝癌细胞的凋亡;细胞划痕和Transwell小室实验结果表明KDM5C敲除显著抑制了细胞迁移侵袭能力。综上所述,本研究分析了KDM5C在肝癌中的表达及定位,通过CRISPR/Cas9进行KDM5C敲除并建立了稳转敲除细胞系。KDM5C基因敲除显著抑制了肝癌细胞增殖,迁移,侵袭,克隆形成,以上结果表明KDM5C通过促进肿瘤的发生在肝癌细胞中发挥功能。
【图文】：
-3-图 1-2 不同甲基化水平的精氨酸结构 组蛋白去甲基化酶组蛋白去甲基化酶，，顾名思义是可以脱去组蛋白甲基化的一类酶，主 类和 jumonji 类[6]。哈佛医学院的施杨教授在 2004 年发现了第一个组化酶[4]，赖氨酸特异性的去甲基化酶 1（LSD1)。LSD1 是一个 FAD 依酶，它能够特异性脱去单甲基化和二甲基化的组蛋白赖氨酸残基上的随着表观遗传学的兴起，发现了更多的组蛋白脱甲基化酶家族，从作分两种主要的组蛋白去甲基化酶：黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖性 Fe2+与 α-酮戊二酸依赖性双加氧酶。二者作用机理如图 1-3 所示[8]。从我们可以看出前者只能催化一甲基或二甲基基团，而不能去掉赖氨酸
图 1-3 两种组蛋白去甲基化酶作用机理（上部为 FAD 依赖性，下部为 α-酮戊二酸依赖性）但是后者就不需要这个 N 上的质子参与反应，因此三个甲基化修饰都可以被去掉。这第二类含有 JmjC 结构域的去甲基化酶是由北卡罗来纳大学的张毅教授于2007 年发现。研究表明，JmjC 结构域在空间上形成 8 个 β 折叠，能够结合二价亚铁离子和 α-酮戊二酸[8]。从而满足 Fe2+与 α-酮戊二酸依赖性双加氧酶催化赖氨酸三甲基化的去除的条件，可以相应的影响端粒的长度，是作为表观遗传修饰的重要途径，可能调控机体增殖，衰老，肿瘤发生等重要生物学过程。1.3 KDM5C 及其研究进展1.3.1 KDM5C 概述KDM5C (JARID1C)，英文名 Lysine (K)-specific demethylase 5C，中文名赖氨酸特异性去甲基化酶 5C，位于 X 染色体上。 KDM5C 是蛋白质编码基因，编码 1560
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
本文编号：2659476
【图文】：
-3-图 1-2 不同甲基化水平的精氨酸结构 组蛋白去甲基化酶组蛋白去甲基化酶，，顾名思义是可以脱去组蛋白甲基化的一类酶，主 类和 jumonji 类[6]。哈佛医学院的施杨教授在 2004 年发现了第一个组化酶[4]，赖氨酸特异性的去甲基化酶 1（LSD1)。LSD1 是一个 FAD 依酶，它能够特异性脱去单甲基化和二甲基化的组蛋白赖氨酸残基上的随着表观遗传学的兴起，发现了更多的组蛋白脱甲基化酶家族，从作分两种主要的组蛋白去甲基化酶：黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖性 Fe2+与 α-酮戊二酸依赖性双加氧酶。二者作用机理如图 1-3 所示[8]。从我们可以看出前者只能催化一甲基或二甲基基团，而不能去掉赖氨酸
图 1-3 两种组蛋白去甲基化酶作用机理（上部为 FAD 依赖性，下部为 α-酮戊二酸依赖性）但是后者就不需要这个 N 上的质子参与反应，因此三个甲基化修饰都可以被去掉。这第二类含有 JmjC 结构域的去甲基化酶是由北卡罗来纳大学的张毅教授于2007 年发现。研究表明，JmjC 结构域在空间上形成 8 个 β 折叠，能够结合二价亚铁离子和 α-酮戊二酸[8]。从而满足 Fe2+与 α-酮戊二酸依赖性双加氧酶催化赖氨酸三甲基化的去除的条件，可以相应的影响端粒的长度，是作为表观遗传修饰的重要途径，可能调控机体增殖，衰老，肿瘤发生等重要生物学过程。1.3 KDM5C 及其研究进展1.3.1 KDM5C 概述KDM5C (JARID1C)，英文名 Lysine (K)-specific demethylase 5C，中文名赖氨酸特异性去甲基化酶 5C，位于 X 染色体上。 KDM5C 是蛋白质编码基因，编码 1560
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【参考文献】
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1 马洁稚;组蛋白H3K4甲基化水平及特异性修饰酶在子宫内膜异位症中的表达研究[D];中南大学;2012年
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