靶向AXL的CAR-T细胞制备及其对实体肿瘤的治疗作用

发布时间：2020-05-13 20:26

【摘要】：嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法已经成为目前治疗肿瘤的前沿技术之一,并且在治疗血液肿瘤中获得了突出的成果。目前已经有两项CAR-T产品在美国获批上市。但CAR-T细胞在治疗实体瘤方面亟待突破。开发针对新治疗靶点的CAR-T细胞依然是目前CAR-T治疗的重要发展方向。AXL是肿瘤细胞高表达的酪氨酸激酶受体,有可能成为实体肿瘤治疗的潜在新靶点。本研究制备了靶向AXL的CAR-T细胞,并利用体内外的模型,评价了AXL-CAR-T对实体肿瘤的治疗作用。首先,我们设计并构建了靶向AXL的第三代CAR分子慢病毒表达载体。它包含了一个全新的AXL抗体scFv结构域的胞外段,IgG4铰链区的跨膜段,以及由两个共刺激区域(CD28胞内段,4-1BB跨膜段和胞内段)和一个CD3ζ基序组成的胞内段。利用磷酸钙沉淀法,将AXL-CAR慢病毒载体和包装质粒pMD2.G和psPAX2共转染293T细胞,获得重组AXL-CAR慢病毒上清,并用超滤纯化的方法,获得了高滴度的重组AXL-CAR慢病毒。我们建立了CAR-T细胞制备的基本流程,获得了高质量的AXL-CAR-T细胞。主要包括:(1)从人的外周血淋巴细胞中分离T淋巴细胞;(2)T淋巴细胞体外培养和激活;(3)用AXL-CAR慢病毒感染T淋巴细胞获得AXL-CAR-T细胞;(4)AXL-CAR-T细胞的体外扩增;(5)CAR分子表达效率的检测。为了更加敏感的检测CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,我们构建了表达荧光素酶的多种肿瘤细胞株。利用荧光素酶(luc)过表达质粒PLKO-cmv-luc包装慢病毒,并感染靶细胞系MDA-MB-231,MCF-7,786-O,769-P,MiapacaII,Panc1,然后用嘌呤霉素筛选,获得luc高表达的靶细胞株。对比传统的Cr~(51)和LDH检测法,荧光素酶工程化肿瘤细胞株能够更加简单,准确的用于检测体外杀伤实验中靶细胞的存活率。为了评估AXL靶点在肿瘤治疗中的临床意义,我们也检测了AXL在肾癌和乳腺癌病人样本中的表达情况。在肾癌组织样本中,肿瘤组织中AXL mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织,同时其配体GAS6的mRNA表达水平也显著高于癌旁正常组织。在乳腺癌组织切片样本中,AXL蛋白的表达水平也高于癌旁正常组织。特别是在三阴性乳腺癌中,AXL高表达的病例占到86%,显著高于其他类型的乳腺癌。这些结果都提示AXL可以成为肿瘤治疗的靶点。其次,我们将制备好的AXL-CAR-T细胞和luc表达的靶细胞系共培养,检测AXL-CAR-T细胞的体外杀伤效果。我们共制备了三个不同的AXL scFv克隆(L1,L7,3D3)的AXL-CAR-T细胞。其中,AXL-L7-CAR-T对于靶细胞系(786-O,769-P,MiapacaII,Panc1)的杀伤能力最强。因此,我们选取AXL-L7-CAR-T细胞作为后续研究的效应细胞,后简称AXL-CAR-T。相比于T细胞和对照Con-CAR-T细胞,AXL-CAR-T细胞对于AXL阳性的多种靶细胞系(MDA-MB-231、786-O、769-P、MiapacaII和Panc1)均有显著的杀伤效果,且杀伤能力随着效靶比的增大而增强。而对于AXL阴性的MCF-7细胞系,AXL-CAR-T的杀伤效果显著减弱。这说明,AXL-CAR-T细胞的杀伤活性是AXL抗原特异性的。这种特异性的高效的细胞杀伤作用,是AXL-CAR-T细胞作为AXL阳性肿瘤临床治疗方法的基础。最后,我们在动物模型中,评价了AXL-CAR-T细胞的体内抗肿瘤效果。我们选用B-NSG小鼠作为动物模型,其重度免疫缺陷的表型,使其成为建立人源细胞移植模型的最佳选择。考虑到TNBC细胞系和患者中AXL的高表达,以及TNBC患者亟需有效的治疗方法,我们选用MDA-MB-231细胞系建立体内动物模型。我们将5×10~6的AXL阳性MDA-MB-231/luc细胞和基质胶的混合物,种植于B-NSG小鼠皮下。十天后,所有小鼠全部荷瘤成功。将荷瘤小鼠分为三组,分别尾静脉注射5×10~6的AXL-CAR-T细胞,T细胞和PBS,观察肿瘤体积和小鼠体重的变化。对比T细胞治疗组和PBS对照组,在AXL-CAR-T细胞治疗的小鼠中,乳腺癌的体积和重量都得到了显著的抑制。而T细胞治疗组和PBS对照组相比,肿瘤的体积和重量都没有显著的差异。这些都证明了AXL-CAR-T细胞对AXL阳性肿瘤有靶向性的杀伤作用。在T细胞上表达AXL-CAR不仅赋予了T细胞靶向性,而且提高了T细胞对肿瘤的杀伤能力。在对小鼠进行细胞治疗的过程中,我们在不同的时间点(治疗后第2天和第12天)收集了小鼠的外周血,检测其中T淋巴细胞的存续情况和CAR分子的表达效率。研究结果表明,治疗后第2天,AXL-CAR-T细胞组和T细胞组中都能检测到人源T细胞,说明尾静脉模型的构建成功。而治疗后第14天,T细胞组中已经检测不到人源T细胞的存续,而AXL-CAR-T细胞组依然能检测到人源T细胞的存续。在AXL-CAR-T细胞治疗组中,治疗后第2天,人源T细胞中CAR分子的表达比例和输注时的AXL-CAR-T细胞中的表达比例相似,证明了我们CAR-T细胞的制备和动物模型的建立是成功的。治疗后第12天,人源T细胞中几乎找不到单纯T细胞的存续,扩增的都是AXL-CAR-T细胞。这证明了CAR分子的表达提高了T细胞的存续能力。在治疗终点时,我们检测了肿瘤浸润的人源T淋巴细胞,只有AXL-CAR-T细胞治疗组中发现了大量人源T细胞的浸润,而T细胞组和PBS组中均未发现。可见AXL-CAR分子的表达,赋予了T细胞靶向性,使得CAR-T细胞能够更好的存续并浸润到肿瘤组织中,发挥杀伤肿瘤的功能。综上所述,我们建立了CAR-T细胞实验室制备的方法和利用荧光素酶工程化靶细胞检测体外杀伤效应的新方法。用全新的AXLscFv序列构建了携带针对AXL的CAR慢病毒载体,包装并制备了重组慢病毒。在此基础上,我们制备了靶向AXL的CAR-T细胞。这种AXL-CAR-T细胞不仅能够在体外特异性的杀伤AXL阳性的多种肿瘤细胞,而且能够在体内抑制AXL阳性肿瘤的生长。本研究为AXL作为肿瘤治疗的新靶点,以及AXL-CAR-T作为实体肿瘤治疗的新方法提供了理论基础。
【图文】：

图表 10 乳腺癌病人样本 AXL 免疫组化染色结果示意图由图 11 所示的 IOD 统计分析结果可见，，组织学分期越高的肿瘤中，达越高。说明，随着乳腺癌的进展，AXL 的蛋白表达升高。但是，由于样没有得到统计学差异。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R73-36

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本文编号：2662495