细胞分子间通讯对细胞活动调控的荧光可视化研究

发布时间：2020-05-14 07:12

【摘要】：癌症,也称为恶性肿瘤,是致死率极高的一类疾病。其难以治愈的原因在于癌细胞具有增殖失控、侵袭转移的特点。在癌症治疗方面,常需要更早地提供一些与肿瘤发展相关的信息,以便于在对癌症患者进行个体化治疗,判断患者的预后,在为易复发和高转移危险的病例选择适当的辅助治疗时,可以提供有效的依据,从而提高患者的治愈率,生存率。随着研究的不断深入,研究者逐渐认识到肿瘤细胞内部基因、蛋白质和酶类等细胞分子间的相互通讯机制,在肿瘤的发生、发展及肿瘤细胞的浸润、转移和复发过程中起着重要作用,许多生物分子的变化常会导致失控的细胞增殖和凋亡,最终发生癌变。因此,研究相关生物分子的表达以及这些生物分子对癌细胞增殖、侵袭等活动的调控,将有助于开发新的靶向治疗药物,有利于肿瘤的个体化治疗和预防。目前检测这些生物分子的方法主要基于生物学方法,但这些方法存在操作繁琐、破坏细胞结构等缺点,不能实时观察生物分子的动态变化。因此,发展行之有效的方法在活细胞和活体水平上同时监测多种生物分子的变化,有助于了解分子间通讯对细胞活动的调控作用,对疗效评估及新药筛选具有重要意义和实用价值!荧光成像分析法因具有快速、无损、可视化检测等优势而成为可视化检测活细胞和活体中生物分子的理想手段。近年来,随着纳米技术领域研究的不断开展,纳米荧光探针已经被广泛应用于分析化学、生物学和医学等相关领域。在这些纳米材料中,金纳米颗粒因其具有独特的生物亲和力和光学性质,在生物分子检测、细胞和活体成像、癌症检测诊断等方面得到了极为广泛的关注。目前大多数的研究只是对某些生物分子进行荧光成像,仍然缺乏对细胞分子间通讯进行可视化研究的手段。而通过成像检测信号通路中的多个关键分子,可视化研究分子间通讯对细胞活动的相关调控更是一个巨大的挑战。为了更好地理解癌症的发展机制、细胞活动的调控机制以及更精准地评估癌症的治疗效果、更快捷可靠地筛选抗肿瘤新药,发展一种荧光纳米探针用于可视化研究细胞中多个生物分子对细胞活动的调控具有非常重要的意义和实用价值。本论文基于细胞中存在的miRNA、mRNA和蛋白酶等多种生物分子,利用金纳米颗粒(AuNPs)、分子信标(MB)和肽链,设计合成了一系列不同的新型复合荧光纳米探针,用于细胞内多种关键分子的同时可视化检测,根据这些分子的荧光信号变化,研究了相关细胞性质和活动的变化,并以此进一步评估了药物的疗效。具体包括:1.基于AuNPs、MB和肽链,利用分步组装的方式,将MB和肽链组装到AuNPs表面,制备了一种多色荧光纳米探针。AuNPs能有效猝灭修饰在MB和肽连上的染料的荧光。当两种MBs遇到miR-221和PTEN mRNA靶标,肽链遇到MMP-9蛋白时,MBs的发夹结构打开,肽链被MMP-9切断,从而导致荧光恢复。该探针通过同时可视化监测PI3K/AKT通路中的miR-221,PTEN mRNA和MMP-9的表达变化,判断细胞迁移和侵袭性质的变化。这种多色纳米探针提供了一种简单、无创、即时和直观的方式对细胞迁移和侵袭进行研究,为进一步建立有效的靶向治疗策略提供了有用的信息。2.构建了一种多色荧光纳米探针。将MB和肽链分步组装到AuNPs表面,MB和肽链上的染料的荧光会被AuNPs猝灭。当遇到增殖标志物Ki-67 mRNA和侵袭标志物uPA蛋白时,MB和肽链的结构被破坏,染料远离AuNPs,荧光得以恢复,从而实现对这两种标志物的同时检测。该探针能够对增殖标志物Ki-67 mRNA和侵袭标志物uPA蛋白进行同时检测和成像,可视化研究了乳腺癌细胞和乳腺癌肿瘤经他莫西芬和姜黄素处理后癌细胞增殖和侵袭性质的变化,依据这些变化对两种药物疗效进行了评估。该研究不但为癌细胞增殖失控、侵袭转移提供了细胞和活体水平检测的新方法,同时为抗肿瘤新药的筛选及药物的疗效提供了一种快捷有效地新途径。3.利用AuNPs、MB和肽链发展了一种复合荧光纳米探针,该探针能够在活细胞水平对EMT的上皮标志物E-cadherin mRNA、间质标志物vimentin mRNA和凋亡标志物Caspase-3进行同时可视化地检测。MB被设计成茎环结构并修饰了荧光信号报告基团。在没有靶分子出现时,MB上修饰的染料荧光会被AuNPs猝灭,当遇到E-cadherin mRNA和vimentin mRNA时,MB的茎环结构打开,染料远离AuNPs,荧光得以恢复。将连接了荧光信号报告基团的肽链修饰到AuNPs,在Caspase-3存在时,肽链识别单元会被特异性切断,末端染料被释放并远离AuNPs,从而使荧光得以恢复。因而所设计的荧光纳米探针能够实现对EMT和凋亡过程的同时检测。根据二者间的关系,考察了不同癌细胞中EMT对凋亡的作用,并标定了 EMT对药物疗效的影响。该研究不但为肿瘤细胞EMT和凋亡的同时可视化检测提供了新方法,而且为靶向EMT的肿瘤用药疗效评价提供了细胞水平检测的新途径。4.本文设计合成了一种新的Au-Se荧光纳米探针,能够对细胞信号通路中有上下游调控关系的侵袭标志物uPA和MMP-9两种蛋白进行实时原位检测。该探针是基于Au-Se键作用,在AuNPs上组装了可特异性检测uPA和MMP-9的两种肽链,当遇到uPA和MMP-9蛋白时,肽链的结构被破坏,染料远离AuNPs,荧光得以恢复,从而实现对这两种蛋白的同时检测。该探针特异性好,反应速度快。与以往制备的Au-S荧光纳米探针相比,Au-Se探针具有更强的抗高含量GSH干扰的能力,能够实时原位检测两种蛋白表达的先后顺序,确定二者在信号通路中的上下游关系,上游的uPA能够激活下游的MMP-9蛋白。本文所设计的Au-Se荧光纳米探针能够适用于复杂的生物体系,可以实现信号通路中上下游蛋白分子及调控关系的实时原位检测,更为重要的是,该探针也为实时原位研究通路中其它信号分子及调控关系提供了新的思路。
【图文】：

金纳米颗粒,物化性质,传感器,基本原理

存在［７３１，是介于原子、分子以及宏观体之间的一种过渡态，是一种含有有限原子逡逑的新物理形态。它具有独特的物理化学性质，如表面效应、量子尺寸效应、小尺逡逑寸效应和精细可调的表面化学等［７３］（图１－２）。目前已经发展了各种基于金纳米逡逑颗粒的传感器，这些传感器被广泛应用于生物检测、生物电化学及生物医学成像逡逑检测等领域１７４，，７５］。首先，金纳米颗粒易于制备可直接合成，而且制备的金纳米颗逡逑粒在储存数月后仍保持物理化学稳定性。其次，金纳米颗粒具有独特的光学性质，逡逑１３逡逑

示意图,荧光探针,细胞内,探针

Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ邋Ｓｏｑｕｏｎｃｅ邋５邋？／＊ｖＡｖ，＼－ＳＨ－３逡逑（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ邋ＤＮＡ）逡逑图１－６基于纳米火焰探针用于检测与转移相关的ｍＲＮＡ靶标的示意图逡逑为避免癌症检测中出现的假阳性结果，研究者一直致力于对多种肿瘤标志物逡逑进行同时检测。唐波课题组基于ＡｕＮＰｓ和ＭＢｓ设计的荧光纳米探针，实现了对逡逑细胞内两种ｍＲＮＡｓ肿瘤标志物的同时检测和成像［｜１２１。将两个末端标记有染料逡逑的ＭＢｓ分子通过Ａｕ－Ｓ键作用修饰到ＡｕＮＰｓ表面，染料由于靠近ＡｕＮＰｓ而使荧逡逑光猝灭。当遇到相应的ｍＲＮＡ靶分子时，ＭＢｓ会与靶分子发生杂交反应，ＭＢｓ逡逑的茎环结构打开而使染料的荧光恢复，所制备的双色荧光纳米探针能够对乳腺癌逡逑１９逡逑Ｉ逡逑
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.2;O657.3

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