地西他滨为基础的协同性免疫疗法治疗微卫星稳定性结直肠癌及机制研究

发布时间：2020-05-15 12:36

【摘要】：结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全球第三大常见的恶性肿瘤,全球每年新发病例数约为140万例,其发病率在男性及女性中均处于恶性实体肿瘤的第3位,癌症相关死亡原因已分别上升至第2位和第3位[1]。近年来,结直肠癌的发病率不断上升,而我国的上升速度是国际平均增速(2%)的2倍,尤其在上海等东南沿海发达城市,发病率达到实体肿瘤的第二位,严重威胁着人类的健康和生活质量[2,3]。肠癌发病隐匿,相当一部分患者在首次就诊确诊时已经发生远处转移[4]。目前对于晚期结直肠癌患者而言,姑息手术、新辅助放化疗以及靶向药物的应用是主要治疗手段,但又由于患者间个体差异和耐药性的出现等,晚期结直肠癌的疗效和预后不够理想[5]。近年来,肿瘤的免疫治疗越来越受到关注。2012年,被Science杂志评为未来值得关注的六大领域之一[6];2013年,又被Science杂志评为“年度十大进展之首”[7];并连续成为2015、2016年全球肿瘤研究顶级盛会——美国临床肿瘤学会(ASCO)热点中的焦点,当仁不让的成为了会议的主旋律[8,9]。Topalian博士因其在PD-1和PD-L1免疫治疗研究的突出贡献,被授予2015年“David A.Karnofsky Memorial Award”(ASCO最重要的奖项)。目前,大量的基础和临床研究已经聚焦肿瘤免疫治疗。结直肠癌患者也从免疫治疗中看到了希望,尤其是错配修复基因缺陷(Mismatch repair deficiency,dMMR)的CRC患者,对PD-1单抗药物的敏感性比微卫星稳定性(Microsatellite stability,MSS)患者显著提高[10]。微卫星不稳定(Microsatellite instability,MSI)是结直肠癌发病的重要原因之一。它是指MSH2、MSH6、MLH1、PMS1和PMS2等错配修复基因发生突变导致DNA重复序列(微卫星)的增加或缺失,进而引起肿瘤的发生[11,12]。由于微卫星序列突变累积,蛋白质翻译过程中发生框移突变,导致肿瘤细胞产生了大量异常的多肽片段,这些片段更容易被免疫系统所识别,激发机体的抗肿瘤免疫应答反应[13],这也是微卫星不稳定患者对PD-1单抗敏感的主要原因。微卫星不稳定性在散发性结直肠癌中的发生频率大约仅为15%[14]。但是对于大部分微卫星稳定性的结直肠癌患者而言,PD-1单抗难以取得显著的疗效,如何提高这部分患者的疗效成为结直肠癌治疗的重大问题。目前,肿瘤免疫疗法联合治疗的应用已经成为全球科学家的共识,综合治疗依旧是癌症的理想治疗模式。在与肿瘤抗争的几百年来,人们已经意识到单凭一种疗法是无法攻克肿瘤这一顽疾的。只有通过不同机制的抗肿瘤协同治疗,如传统放化疗与免疫疗法联用、治疗性疫苗与免疫检查点抑制剂联用、CAR-T疗法与免疫检查点抑制剂联用、靶向药物与免疫疗法联用,以及肿瘤免疫疗法与基因疗法联用等[15-19]。在传统的手术、放疗以及化疗使肿瘤细胞负荷明显降低,机体的免疫功能得以改善的基础上,通过联合适当的肿瘤免疫治疗,可以清除微小的残留病灶或抑制残留癌症细胞增殖,改善癌症患者的预后,延长生存时间,提高生活质量,从而达到治愈癌症的目的。深入理解肿瘤和免疫系统之间的相互作用,利用各种免疫治疗手段的优势,互相协同发挥抗肿瘤作用,优化肿瘤治疗方案成为当前研究的热点。地西他滨(5-aza-2'-deoxynucleoside,DAC)是一种腺苷类似物,通过抑制DNA甲基转移酶,降低DNA的甲基化水平,从而抑制肿瘤细胞的增殖,是作用能力较强的DNA甲基化特异性抑制剂,已经广泛应用于骨髓增生异常综合征、急性白血病的治疗,作为甲基化抑制剂也在实体瘤中被广泛研究。研究证明,低剂量DAC不仅可以明显诱导和提高肿瘤抗原的表达,如NY-ESO-1、MAGE-A3/6等,还能提高CD80、MHC-I类分子等免疫标志物的表达[20,21],进而增加肿瘤局部免疫细胞的浸润,为免疫检查点抑制剂、治疗性疫苗、过继性细胞治疗等免疫疗法提供了更加适合的免疫微环境。本课题旨在研究低剂量DAC对肿瘤生物学特征、免疫原性的影响以及对肿瘤微环境的作用及其机制,探讨其与PD-1单抗、NY-ESO-1特异性TCR-T细胞等免疫治疗的协同效应,为MSS结直肠癌的临床治疗提供新的策略和科学依据。本研究主要分为三个部分:第一部分:低剂量地西他滨对肿瘤的表观修饰作用研究DNA甲基化是一种不改变基因碱基序列的可逆的基因修饰,其甲基化水平与基因的“开放”状态密切相关。基于低剂量DAC的去甲基化作用,我们对微卫星稳定的小鼠肠癌细胞系CT26[22]进行了DAC处理,提取了基因组DNA和总RNA,利用全基因组甲基化测序(WGBS)和全转录组测序(RNA-seq)对肿瘤细胞的特征改变进行了检测和分析,结果发现CT26细胞经过DAC处理后,基因组总体甲基化水平显著下调。其中,抗原加工和递呈相关基因、细胞因子相关基因和趋化因子以及STAT基因、免疫应答相关基因、MAPK信号传导途径基因和PI3K-AKT信号传导途径相关基因中启动子区域的甲基化水平显著下调。全转录组测序结果显示,CT26细胞的表达谱明显改变,发现大量差异表达的功能相关基因,包括180个上调的基因和139个下调的基因。我们着重关注了WGBS结果中甲基化水平发生变化的mRNA的表达情况。结果发现,抗原加工和递呈相关基因、细胞因子相关基因、趋化因子相关基因,STAT基因,免疫应答相关基因,MAPK信号传导途径基因和PI3K-AKT信号传导途径基因的表达发生明显改变。值得注意的是,抗原加工和递呈相关基因显著上调。这表明基因启动子区的高甲基化水平可以抑制基因的表达,当甲基化水平被下调时,基因表达重新被激活,表达水平上升,即上述基因的表达水平与其启动子区甲基化水平具有相关性。肿瘤细胞在经过DAC处理后,基因组甲基化水平明显下降,细胞表达谱发生了明显变化,其免疫原性得到提高。同时,我们收集了临床患者的新鲜肿瘤组织,在重度免疫缺陷NCG小鼠上构建了CRC的PDX模型,并根据美国国立癌症研究所Boland等[23]的标准进行了微卫星状态的鉴定。我们选取了MSS的PDX模型予以DAC处理,提取了肿瘤组织的基因组DNA和总RNA,也进行了WGBS和RNA-seq检测和分析。我们发现了与CT26细胞经DAC处理后类似的现象:PDX模型的肿瘤细胞经过DAC处理后,其甲基化水平显著下调。其中,抗原加工和递呈相关基因,免疫相关基因和蛋白质修饰基因中启动子区域的甲基化水平被下调。表达谱也发生了显著变化,其中有89个基因显著上调,50个基因显著下调。上调基因主要是抗原加工和递呈基因,免疫相关基因和蛋白修饰基因,与WGBS结果显示的低甲基化水平具有一致性。这说明低剂量DAC改变了PDX肿瘤的特性,提高了其免疫原性。为了探究DAC对不同微卫星状态的CRC细胞的影响,我们选取了两株MSI细胞HCT116、LOVO和两株MSS细胞HT29、SW480,用0μM、0.1μM、1μM、10μM等不同浓度的DAC进行处理,在处理后的不同时间点(第1天,第3天,第7天)收集了肿瘤细胞的总RNA、DNA和蛋白质,通过qPCR、Western Blot等技术检测了细胞中NY-ESO-1抗原mRNA和蛋白的表达水平,并通过甲基化测序检测了基因组DNA中NY-ESO-1启动子区的甲基化情况。结果显示,低剂量DAC可诱导或提高CRC细胞系中NY-ESO-1基因的表达。在MSS细胞系中,HT29和SW480的NY-ESO-1表达需要更低浓度DAC的诱导,诱导所需的时间也更短,NY-ESO-1表达水平比未处理的细胞平均升高20-30倍,显著的高于MSI细胞中的5-10倍。而NY-ESO-1启动子区的甲基化水平与其基因表达水平也密切相关,甲基化水平越低,其表达水平越高。通过第一部分的研究,我们证实了小鼠微卫星稳定性肠癌细胞系CT26细胞经过低剂量DAC处理后,其基因组甲基化水平明显下调,重新激活或上调了大量功能基因的表达,改变了肿瘤的免疫学特征,提高了其免疫原性。在PDX肿瘤模型中,这一现象得到了再次验证。该部分研究结果为下一步的研究提供了理论依据。第二部分:低剂量地西他滨对肿瘤微环境的作用研究影响免疫治疗在实体瘤中疗效的主要问题是肿瘤抑制性的免疫微环境。如何打破和重塑肿瘤微环境,激发机体的抗肿瘤免疫应答是实体瘤治疗取得突破的关键。肿瘤微环境中的免疫微环境决定了免疫治疗的有效性[24-27],而免疫相关分子的表达及细胞的浸润是肿瘤微环境的关键组成。第一部分中,我们已经证实了低剂量DAC可以改变肿瘤的特征,提高其免疫原性。我们又构建了CT26荷瘤小鼠模型,给予荷瘤小鼠DAC处理,同时PBS和Cytidine(胞嘧啶类似物)作为对照,收集了DAC处理后不同时间点(处理前,处理后1天,处理后3天,处理后7天,处理后14天)的肿瘤组织,通过免疫组化检测肿瘤微环境中的淋巴细胞浸润情况和细胞状态等,进一步探究了低剂量DAC对肿瘤微环境的影响。我们发现,在低剂量DAC处理后,随着时间的延长,浸润到肿瘤局部的T淋巴细胞越来越多,7-14天后达到峰值。进一步检测肿瘤微环境中的CD3~+T细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞的浸润,分泌IFN-γ细胞因子的细胞数量以及PD-1的表达情况,发现DAC处理组相比于对照组有更多的T淋巴细胞浸润,包括CD4~+T淋巴细胞和CD8~+T淋巴细胞;且分泌IFN-γ细胞因子的细胞数量显著高于PBS组和Cytidine组。值得注意的是,我们发现大部分浸润的T淋巴细胞均为PD-1阳性,这表明DAC对于TME的影响作用可能通过PD-1/PD-L1通路被抑制。通过第二部分的研究,我们发现了低剂量DAC可以重塑肿瘤微环境,召募更多的T淋巴细胞,包括CD4~+T细胞、CD8~+T细胞,浸润到肿瘤局部,且大部分细胞分泌高水平的IFN-γ,但是这些细胞大部分是PD-1阳性的,其功能可能通过PD-1/PD-L1通路被抑制。第三部分:地西他滨为基础的协同免疫治疗策略的研究一、地西他滨与PD-1抑制剂协同性治疗策略研究研究证明,PD-1单抗对于MSS肿瘤基本上是无效的[10]。通过前面两部分的研究,我们发现低剂量DAC可以改变肿瘤的免疫学特征,提高其免疫原性,且能够召募大量的T淋巴细胞浸润到肿瘤局部,从而有可能对肿瘤微环境进行重塑。但是这部分浸润到肿瘤局部的T淋巴细胞大部分为PD-1阳性,因此我们紧接着联合应用PD-1单抗,探讨协同效应提高疗效的可能性。在这一部分中,我们首先选取CT-26小鼠肠癌细胞构建了MSS的荷瘤小鼠模型,给予了DAC+PD-1单抗联合用药的治疗方法,将PBS、PD-1单抗单药、DAC单药治疗作为对照组,探讨了DAC与PD-1单抗协同治疗的疗效。结果显示,DAC+PD-1单抗组与PD-1单抗组、DAC单药组相比,对肿瘤生长具有明显的抑制作用,延长小鼠生存期的效应也更加显著。结果表明,DAC的预处理联合PD-1单抗的治疗方法,能够明显抑制MSS荷瘤小鼠的肿瘤生长和延长其生存期,结合第一部分的体外细胞学实验,其机制可能是由于DAC对肿瘤细胞的效应而招募到肿瘤局部的PD-1阳性的T淋巴细胞被PD-1单抗解除抑制,从而在肿瘤局部发挥了抗肿瘤效应。二、地西他滨与TCR-T细胞治疗协同性治疗策略研究在第一部分中,我们证实了DAC可以诱导和提高MSS肿瘤细胞NY-ESO-1抗原的表达,而肿瘤抗原的表达直接决定着特异性细胞免疫治疗的效应。因此,我们探索了将DAC与NY-ESO-1特异性的T细胞进行协同治疗的疗效。首先,我们从文献和数据库中获得了NY-ESO-1_(157-165)(SLLMWITQC)特异性TCRα/β基因序列,将α链95-96位的TS突变为LY,以提高其抗原特异性杀伤功能[28,29];另外,将α链的Thr~(48)和β链的Ser~(57)突变成Cys,有利于形成二硫键,提高其与外源基因的匹配成功率[30]。TCRα/β链基因之间用具有“self-cleavege”功能的P2A连接,使翻译出来的产物能够被剪切成α/β链,从而更好地进行匹配[30,31]。优化后的序列克隆入慢病毒过表达载体,利用HEK-293T细胞包装慢病毒。随后,我们又从人的外周血中分离出淋巴细胞,经过流式检测HLA-A2表型,筛选出HLA-A2强阳性的淋巴细胞经CD3~+/CD28~+Dynabeads进行分选和活化。利用包装好的慢病毒转染活化的CD3~+/CD28~+/HLA-A2~+淋巴细胞,流式检测其TCR表达情况,MHC-Tetramer检测其与抗原的结合能力。结果显示,特异性TCR的转染效率为56%,四聚体检测其特异性结合的阳性率为15%,说明我们成功制备了NY-ESO-1特异性TCR-T细胞。为了在体外检测所构建的TCR-T细胞能否识别NY-ESO-1抗原并分泌细胞因子,我们将HLA-A2特异性的NY-ESO-1_(157-165)(SLLMWITQC)多肽和无关同源多肽OVA_(257-264)(SIINFEKL)负载到T2细胞上作为靶细胞,所构建的TCR-T细胞与负载抗原的T2细胞共培养24 h,ELISPOT检测培养上清中IFN-γ的释放,结果显示,与负载NY-ESO-1_(157-165)的T2细胞共培养的TCR-T细胞能够高分泌IFN-γ,并且明显高于负载无关同源多肽的T2细胞所共培养的TCR-T细胞。以上结果表明所构建的TCR-T细胞可以特异性的识别T2细胞上的NY-ESO-1并诱导分泌细胞因子IFN-γ。随后,我们通过体外实验进一步验证了所构建TCR-T细胞的杀伤效应。选取了HLA-A2和NY-ESO-1不同表型的肿瘤细胞作为靶细胞:LOVO(NY-ESO-1~-/HLA-A2~-),MGC 803(NY-ESO-1~+/HLA-A2~-),SW480(NY-ESO-1~±/HLA-A2~+),A375细胞(NY-ESO-1~(++)/HLA-A2~+)做阳性对照,以及根据第一部分WB结果,经过1μM DAC诱导的HCT116(NY-ESO-1~+/HLA-A2~+)。将靶细胞与所构建的TCR-T细胞共培养,LDH Assay检测TCR-T的杀伤效应,ELISPOT检测TCR-T的IFN-γ的分泌。结果显示,A375、HCT116与TCR-T细胞共培养的孔中可见大量斑点形成,数量远远高于LOVO、MGC 803、SW480与TCR-T共培养的孔,即与A375、HCT116共培养的TCR-T细胞释放了大量的IFN-γ。相应地,A375、HCT116与TCR-T细胞共培养的孔中检测到大量LDH的释放,其含量远高于LOVO、MGC 803、SW480与TCR-T共培养的孔,即TCR-T细胞对A375、HCT116细胞产生了较好的杀伤效应。体外实验说明,TCR-T细胞对NY-ESO-1~+/HLA-A2~+细胞具有特异性的杀伤作用,对于NY-ESO-1或HLA-A2单阳性或双阴性的细胞没有杀伤效应。体内实验中,我们构建了A375荷瘤小鼠模型,予以所获得的TCR-T细胞输注治疗,PBS和空病毒转染的T细胞(ctrl-T细胞)作为对照。结果发现,所构建的TCR-T细胞能够显著抑制小鼠体内肿瘤的生长,并显著延长小鼠的生存时间。上述实验结果证实,我们所构建的NY-ESO-1特异性TCR-T细胞在体内和体外均可有抗原特异性的IFN-γ的分泌,并且具有HLA-A2限制性的NY-ESO-1特异性的肿瘤杀伤效应。在成功获得NY-ESO-1 TCR-T细胞后,我们进一步研究了DAC与TCR-T细胞是否具有协同治疗效应。体外实验中,我们采用0μM、0.1μM、1μM等不同浓度的DAC处理SW480细胞(NY-ESO-1~±/HLA-A2~+),并按照10:1、20:1、40:1等不同的效靶比与所构建的TCR-T细胞共培养。结果证明,与未诱导的SW480细胞组相比,DAC诱导过的SW480细胞与所构建的TCR-T细胞共培养后,LDH Assay检测显示所构建的TCR-T细胞对DAC处理的SW480细胞的杀伤效应明显高于未处理的SW480细胞。ELISPOT结果显示,与未处理的SW480细胞组相比,DAC诱导过的SW480细胞与所构建的TCR-T细胞共培养后,上清中IFN-γ细胞因子的水平明显升高。体内实验中,我们将0μM、0.1μM、1μM等不同浓度的DAC处理的SW480细胞接种到重症免疫缺陷NPG小鼠皮下,构建了MSS的SW480荷瘤小鼠模型,然后进行所构建的TCR-T细胞的输注治疗,每周一次,共三次,同时PBS和空病毒转染的T细胞(ctrl-T细胞)作为对照,结果显示,未经DAC诱导的SW480细胞和经过0.1μM DAC处理的SW480细胞组,在经过TCR-T细胞治疗后,其肿瘤生长得到一定的抑制,但是生存时间并没有得到延长。1μM DAC处理组经过TCR-T细胞的输注治疗后,肿瘤生长的抑制效应和生存期的延长明显高于其它组。上述结果表明,MSS肿瘤细胞经过适当浓度的DAC(1μM)的处理,能够明显的提高其对于TCR-T细胞的杀伤敏感性,从而抑制MSS肿瘤的生长并提高生存期,证实适量DAC与TCR-T细胞联合治疗具有协同抗肿瘤效应。通过本部分的研究,我们通过将DAC分别与两种免疫治疗方法PD-1单抗、NY-ESO-1特异性TCR-T细胞联合应用,通过体内外实验,证实了DAC可以提高PD-1单抗、NY-ESO-1特异性TCR-T细胞的免疫治疗的疗效,对MSS肿瘤发挥了协同治疗效应,为MSS肿瘤患者提供了新的治疗策略和依据。同时,DAC特异性诱导肿瘤细胞表达NY-ESO-1等多种肿瘤抗原,为治疗性疫苗、TCR-T细胞等以抗原为基础的免疫治疗提供了更多的靶点,以DAC为基础的协同免疫治疗有望显著提高实体肿瘤患者的临床疗效。全文结果与结论:1、低剂量DAC可以显著降低小鼠结直肠癌细胞CT26细胞以及人MSS性CRC的PDX模型肿瘤细胞基因组甲基化水平,提高结直肠癌细胞中抗原加工递呈、细胞因子等基因的表达水平。低剂量DAC能够通过靶基因启动子区的去甲基化作用,诱导和提高MSI-H以及MSS性CRC细胞中NY-ESO-1抗原的表达。说明低剂量DAC改变了CRC细胞的免疫学特性,提高了其免疫原性。2、经过低剂量DAC处理后的CRC肿瘤可以招募更多的CD4~+和CD8~+T淋巴细胞浸润到肿瘤局部,具有更多的高分泌IFN-γ的细胞。这些浸润的T淋巴细胞大多呈现PD-1阳性。说明低剂量DAC改变了CRC的肿瘤微环境,但是其状态可能通过PD/PD-L1通路被抑制。3、低剂量DAC与PD-1单抗联合应用可以显著抑制小鼠体内CRC肿瘤CT26的生长,并延长小鼠的生存期。说明低剂量DAC为PD-1单抗疗效的发挥提供了良好的肿瘤微环境,而PD-1单抗再次激活了肿瘤微环境中被PD-1/PD-L1通路抑制的T淋巴细胞,发挥抗肿瘤效应。DAC和PD-1单抗能够发挥协同性作用,提高抗肿瘤疗效。4、通过慢病毒转染人外周血T淋巴细胞,成功制备了NY-ESO-1特异性TCR-T细胞,并在体内外进行了功能验证。所制备的TCR-T细胞对HLA-A2限制性的NY-ESO-1阳性肿瘤具有良好的特异性识别和杀伤能力。5、低剂量DAC的预处理可以提高MSS性结直肠癌细胞中NY-ESO-1抗原的表达水平,与TCR-T细胞联合应用可以明显抑制肿瘤生长,延长小鼠生存期。说明低剂量DAC对肿瘤细胞的诱导为TCR-T细胞发挥抗肿瘤效应提供更多的靶点,提高TCR-T细胞治疗的疗效,两者具有协同作用。
【图文】：

全基因组,细胞的,甲基化,测序

- 32 -图 1：CT26 细胞的全基因组甲基化测序结果Figure 1: Low dose DAC decreased the methylation level of promoter region in CT26 cells.(A) Violin map showed the methylation level of the control and the DAC-treated CT26 cells.Each violin represented a sample and every10 kb was regarded as a bin. (B) Comparison ofthe methylation level of antigen processing and presenting gene promoter regions in thecontrol and the DAC-treated CT26 cells. (C) Comparison of the methylation level ofrepresentative differentially expressed genes of the control and the DAC-treated CT26 cells.

全基因组,甲基化,测序,甲基化水平

也发现了与 CT26 细胞类似的结果。PDX 模型的肿瘤细胞经过 DAC 处理后，其甲基化水平显著下调（图2A）。聚类分析发现，抗原加工和递呈基因，，免疫相关基因和蛋白质修饰基因中启动子区域的甲基化水平明显下调（图 2B）。低剂量 DAC 能够显著降低 PDX 模型中肿瘤细胞的甲基化水平说明其在体内也同样可以发挥去甲基化的作用。图 2：PDX 肿瘤的全基因组甲基化测序结果Figure 2: Low dose DAC decreased the methylation level of promoter region in tumors fromthe PDX model. (A) Violin map showed the methylation level of the control and the DAC-treated tumors. (B) Comparison of the methylation level of representative differentiallyexpressed genes in the control and the DAC-treated tumors.3. 低剂量 DAC 对 CT26 细胞表达谱的影响为了阐明低剂量 DAC 作用后的肿瘤细胞其基因的甲基化水平与表达之间的关系，我们对低剂量 DAC 处理和未处理的 CT26 细胞进行了全转录组测序。PCA 分析结果显示，分别代表 CT26 细胞经 DAC 处理前、后的两个点相距很远（图 3A，红色点代表 DAC 处理前，蓝色点代表 DAC 处理后），说明 CT26 细胞在经过低剂量 DAC 处
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

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