Rsf-1通过NF-κB信号通路来调节恶性黑色素瘤细胞增殖、侵袭、凋亡及耐药性

发布时间：2020-05-15 14:32

【摘要】：目的:近几十年来,恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)的发病率和死亡率均明显上升,其恶性程度较高,最多累及的器官是皮肤。虽然部分早期患者可通过手术治疗得到治愈,而其较早转移、死亡率高,放化疗对其作用较差,很多患者预后不良。黑色素瘤的具体病因目前还不明确,主要认为可能与过长时间紫外线照射有一定关系。所以,揭示恶性黑色素瘤发病分子机制,发现关键分子或靶点,对于诊断和治疗恶性黑色素瘤具有重要的理论和临床意义。Rsf-l是染色体重塑复合物ISWI的一个亚单位。染色体重塑复合物使染色质发生重塑而调节核酸合成,转录调节,DNA修复、甲基化及重组等关键生物活动,该复合物的任何组成蛋白发生异常时会引起基因的异常表达和肿瘤的发生。近些年来,对于恶性黑色素瘤的研究很多,已表明11q13区的基因在食管癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、及恶性黑色素瘤中都有扩增,同属11q13.5染色体区的Rsf-1基因在口腔鳞状细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等上皮恶性肿瘤中存在Rsf-1的过表达和/或基因扩增,其表达上调与肿瘤的增殖、侵袭等等的不良生物学行为有关,并且与肿瘤患者预后不良有关,也有文献报道称扩增后高表达的Rsf-1蛋白可以与hSNF2H形成RSF复合体,使染色质结构发生重塑后使某些基因表达增强进而导致肿瘤的发生。但Rsf-1在恶性黑色素瘤中的表达情况及生物学作用尚未见报道。我们应用免疫组化的方法检测Rsf-1在恶性黑色素瘤中的表达情况,采用小RNA干扰技术敲除黑色素瘤细胞中的Rsf-1,检测其对细胞的侵袭以及增殖、凋亡等生物学行为的影响,同时探讨其可能发生分子机制。为进一步恶性黑色素瘤的发病机理和生物学行为及寻找诊断和治疗手段提供理论和临床基础。方法与结果:1、在人黑色素瘤组织标本中检测Rsf-1表达情况,对比癌与正常皮肤间的表达差异。我们选取52例黑色素瘤组织和对应的正常皮肤组织进行免疫组织化学染色,结果发现Rsf-1在肿瘤组织中表达明显高于正常皮肤组织。与之前的文献报道一致,Rsf-1在恶性黑色素瘤中定位于细胞核,其阳性表达率为40.4%(21/52)。2、在人黑色素瘤细胞系中转染和干扰Rsf-1后,检测Rsf-1对黑色素瘤细胞增殖和侵袭能力的影响。我们在内源性高表达Rsf-1的MV3和A375黑色素瘤细胞系中用siRNA敲除Rsf-1。在内源性低表达Rsf-1的M14细胞中转染Rsf-1质粒。MTT,克隆形成实验及细胞周期实验发现,Rsf-1敲除抑制细胞增殖,阻滞细胞周期进程。而Transwell侵袭实验结果显示下调Rsf-1抑制细胞侵袭。3、通过检测细胞增殖及侵袭相关蛋白来探讨Rsf-1促进黑色素瘤细胞增殖和侵袭的可能机制。我们用Western Blot方法检测黑色素瘤细胞中Rsf-1水平变化对细胞增殖及侵袭相关蛋白cyclin E,MMP2和p-IκB的影响。结果显示,Rsf-1敲除能下调cyclin E,MMP2和p-IκB的蛋白水平。我们还通过免疫共沉淀的方法证实了Rsf-1和hSNF2H在黑色素瘤细胞中的结合。4、通过紫杉醇诱导凋亡后,转染以及干扰Rsf-1,检测Rsf-1对黑色素瘤细胞存活率,凋亡率以及线粒体膜电位变化的影响。我们在黑色素瘤细胞MV3,A375和M14中加入5μm的紫杉醇诱导凋亡,然后再干扰或转染Rsf-1,调节Rsf-1的表达。MTT实验结果显示抑制Rsf-1可以明显减少恶性黑色素瘤细胞的存活率,Annexin V-FITC细胞凋亡双染实验显示抑制Rsf-1可以明显增加恶性黑色素瘤细胞的凋亡。流式细胞术检测细胞线粒体膜电位变化显示Rsf-1干扰可以下调肿瘤细胞线粒体膜电位。5、通过检测细胞凋亡相关蛋白来探讨Rsf-1抑制黑色素瘤细胞凋亡的可能机制。我们用Western Blot方法检测黑色素瘤细胞中Rsf-1水平变化对凋亡抑制因子Bcl-2、cIAP1、cIAP2蛋白和促凋亡因子Bax的影响。结果显示,Rsf-1敲除可以显著减少凋亡抑制因子Bcl-2、cIAP1、cIAP2蛋白的表达,增加促凋亡因子Bax蛋白的表达。细胞经NF-κB信号通路抑制剂处理后,Western Blot方法检测Rsf-1对Bcl-2以及bax的调控作用丧失。结论:1、Rsf-1在正常组织中表达明显低于黑色素瘤,阳性表达率为40.4%(21/52)。2、干扰Rsf-1抑制黑色素瘤细胞的增殖和侵袭能力。3、干扰Rsf-1下调黑色素瘤细胞中MMP2和cyclin E的表达及IκB的磷酸化。4、Rsf-1在黑色素瘤细胞中能与hSNF2H结合。5、干扰Rsf-1降低恶性黑色素瘤细胞经紫杉醇诱导后的存活率,增加细胞的凋亡率,降低细胞线粒体膜电位。6、干扰Rsf-1减少凋亡抑制因子Bcl-2、cIAP1、cIAP2蛋白的表达,增加促凋亡因子Bax蛋白的表达。7、干扰Rsf-1抑制黑色素瘤细胞中NF-κB信号通路活性水平。
【图文】：

限将其分为四段，并且把他们分别记录为强度相乘得到它的表达的分值，，我们规定中表明了正常的肺脏组织都≤4 分），并将≥3 结果比，Rsf-1 在人黑色素瘤组织标本中组织化学方法检测 52 例黑色素瘤组织，结果显示 Rsf-1 在正常皮肤组织中呈现恶性黑色素瘤组织中呈现细胞核的阳性表 Rsf-1 呈中度阳性表达（图 1-3），Rsf-1 性黑色素瘤细胞中 Rsf-1 呈阴性表达（图

Rsf-1在恶性黑色素瘤中呈阴性表达（×200），细胞核染色呈阴性反应（紫色）
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.5

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本文编号：2665186