Notch信号通路及其抑制剂在耐药非小细胞肺癌治疗中的影响和机制探讨

发布时间：2020-05-15 16:51

【摘要】：研究背景:肿瘤是细胞分裂与细胞死亡失衡的一类疾病。在世界范围内,肺癌已成为是肿瘤死亡的首要原因。而在我国城市人口中,肺癌患者的死亡已上升为占肿瘤死亡原因第一位~([1])。在确诊肺癌的患者中只有16%生存期超过五年或以上。按照病理类型分类,肺癌中的85%以上为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)~([2])。目前,手术仍是非小细胞肺癌的首选的治疗方法,然而对于不适合手术的晚期患者或需要进行术后治疗的患者来说,化疗仍是最主要的治疗手段。虽然目前用于化疗的药物及治疗方案多样,也在一定程度上可以改善晚期肺癌的患者的预后,但由于不可避免的药物毒性及逐渐出现的药物耐药,仍然使大多数患者最终仍然出现治疗失败的结果。肿瘤药物的化学耐药已经成为是化学治疗抗癌失败的主要原因。因此,进一步延长NSCLC患者生存期,缓解肿瘤患者临床症状成为了目前临床治疗的主要目的~([3,4])。吉西他滨与紫杉醇均为临床上疗效较佳的化疗药物。吉西他滨是核苷类药物,其作用机理是通过杀伤S期肿瘤细胞,并且阻断增殖细胞由G1向S期转化进展~([5])。吉西他滨具有抑制DNA合成作用,从而杀伤肿瘤细胞;同时还可提高肿瘤细胞对其他药物的敏感性。紫杉醇的作用机制主要是通过促进微管蛋白二聚体的组合并阻止其解聚而达到稳定微管的作用,从而抑制了细胞有丝分裂期至关重要的微管的正常动态重组,将细胞周期阻断于G2/M期,阻碍肿瘤细胞复制,使癌细胞无法继续分裂而死亡。同时紫杉醇还有诱发癌细胞凋亡和调节人体机能的作用~([6])。然而,耐药现象的出现导致以吉西他滨和紫杉醇这两种药物为主的治疗不能取得较佳的临床疗效,致使肺癌治疗的困难加大。Notch信号通路参与了细胞增殖、分化、凋亡、黏附及上皮-间质转化等过程,其异常可能导致肿瘤生成~([7])。异常活化的Notch通路可能通过其下游的蛋白调控着肿瘤细胞的增殖和侵袭~([8])。有研究表明,Notch通路的异常活化与卵巢癌耐药性有关。Notch3活化的卵巢癌细胞对铂依赖的化疗药物能产生耐药性~([9])。我们既往研究也表明,Notch信号通路在非小细胞肺癌预后中存在作用~([10])。针对患者对吉西他滨和紫杉醇的耐药性导致临床效果不佳的问题,为探寻解决办法,我们从Notch信号通路着手研究。探讨该信号通路在吉西他滨和紫杉醇的耐药中的作用,为非小细胞肺癌耐药寻找新的治疗方案。研究目的:(1)探讨Notch信号通路在耐药非小细胞肺癌治疗中作用:检测Notch信号通路阻断剂GSI-IX干预后,紫杉醇和吉西他滨对H1299细胞和A549细胞克隆形成的影响。(2)检测紫杉醇和吉西他滨耐药细胞株中Notch3蛋白的表达情况和变化。分析Notch信号通路在肺癌耐药中的作用。(3)研究比较对紫杉醇和吉西他滨对各自耐药细胞株的生长抑制作用是否存在交叉敏感性。(4)分析Notch信号通路阻断剂GSI-IX对耐药肺癌细胞生长、增殖、凋亡的影响,从而探讨GSI-IX能否通过激活凋亡途径来诱导细胞凋亡,从而提高化疗药物紫杉醇和吉西他滨在耐药细胞中的敏感性。实验方法:(1)细胞培养:本研究培养H1299和A549细胞,并分别用紫杉醇和吉西他滨诱导出相应的耐药细胞株。(2)用Western blot方法分别检测H1299和A549细胞及相应的紫杉醇和吉西他滨耐药细胞中Notch3、Bcl-2和Bax蛋白表达情况。(3)采用MTT方法检测GSI-IX单独干预和协同紫杉醇、吉西他滨对相应的耐药H1299和A549细胞增殖能力的影响。(4)流式细胞术检测GSI-IX单独作用和协同作用紫杉醇、吉西他滨对相应耐药H1299和A549细胞凋亡作用的影响。结果:(1)分析比较GSI-IX、吉西他滨、紫杉醇单独和联合作用于H1299细胞和A549细胞后对细胞克隆数的影响。结果显示:GSI-IX组的细胞克隆数减少,其作用与单纯吉西他滨、单纯紫杉醇作用比较,作用相当。并且GSI-IX联合吉西他滨组对两种细胞克隆数减少的影响作用最大。提示GSI-IX可以提高吉西他滨对肿瘤细胞的化疗敏感性。(2)检测吉西他滨和紫杉醇耐药细胞株中的Notch3蛋白的表达情况显示:耐药细胞中的Notch3蛋白明显比非耐药细胞中的Notch3蛋白增加。比较GSI-IX加入4组耐药细胞后Notch3蛋白表达水平与单独的耐药细胞株中的Notch3蛋白表达水平,前者较后者明显减少。说明Notch3信号通路与肿瘤耐药有关,可能参与了肿瘤耐药的进程。(3)检测吉西他滨和紫杉醇在对4组耐药细胞的生长抑制作用。结果显示吉西他滨作用于紫杉醇耐药的2组细胞,其对细胞的生长抑制作用比作用于吉西他滨耐药的2组细胞生长抑制作用强。同时紫杉醇对吉西他滨耐药的2组细胞生长抑制作用强于紫杉醇耐药的2组细胞。说明紫杉醇和吉西他滨不存在交叉耐药现象,反而交叉使用可以提高化疗敏感性。(4)检测GSI-IX对4种耐药细胞增殖力的影响。结果显示,与空白对照组相比,GSI-IX组及GSI-IX联合吉西他滨或紫杉醇组明显抑制了细胞的增殖;与单纯吉西他滨或紫杉醇组相比,GSI-IX提高了吉西他滨或紫杉醇对4种耐药细胞的生长抑制作用。并且,不同浓度的GSI-IX对耐药细胞的抑制作用不同,20um浓度,抑制作用最强。表明GSI-IX可提高了吉西他滨或紫杉醇的药物敏感性。(5)检测GSI-IX作用于4种耐药细胞后,增加了细胞的凋亡,同时检测Bcl-2和Bax的表达水平,结果显示随着GSI-IX作用浓度的增加,Bcl-2表达下调伴随Bax表达水平上调,据此,推测GSI-IX调控凋亡蛋白的表达,从而影响吉西他滨和紫杉醇对耐药细胞的抗肿瘤作用。结论:(1)通过比较GSI-IX和紫杉醇、吉西他滨对肺癌细胞的作用,可以得出GSI-IX有如同化疗药物吉西他滨、紫杉醇类似的抗肿瘤作用。GSI-IX联合吉西他滨可作为肺癌化疗的新的治疗方案。(2)GSI-IX能降低耐药细胞中Notch3蛋白表达,且GSI-IX作用于耐药细胞可提高不同耐药细胞的生长抑制作用,同时能提高吉西他滨或紫杉醇的抗肿瘤作用。我们可以此推论Notch3信号通路参与肿瘤耐药,阻断Notch3信号通路可提高耐药肿瘤细胞的药物敏感性。(3)GSI-IX对耐药细胞株可增加细胞的凋亡率,相关凋亡蛋白Bcl-2和Bax也呈现相应变化。可以推测GSI-IX通过调控凋亡途径,从而改变耐药H1299细胞和A549细胞对化疗药物的抵抗。表明GSI-IX有可能通过促进肿瘤细胞凋亡,从而达到治疗非小细胞肺癌目的。
【图文】：

紫杉醇,细胞克隆,安徽医科大学

安徽医科大学博士学位论文同时单纯 GSI-IX 组的细胞克隆减少率可堪比单纯紫杉醇组。并且在这六组中，紫杉醇+ GSI-IX 组对细胞克隆数量减少的影响最大，其与单纯紫杉醇组相比较，差别有统计学意义(P<0.05)，，（见图 1）。这提示 GSI-IX 除了可通过抑制细胞克隆途径抑制肿瘤生长，还可以提高紫杉醇对肿瘤细胞抑制作用的敏感性。

吉西他滨,细胞克隆

安徽医科大学博士学位论文对照组、单纯 GSI-IX 组、单纯吉西他滨组和吉西他滨+DMSO 组和吉西他滨+GSI-IX 组。我们发现加入吉西他滨的三组对两种细胞均不同程度的减少了细胞克隆数量，同时单纯 GSI-IX 组的细胞克隆减少率可堪比单纯吉西他滨组。并且在这六组中，吉西他滨+ GSI-IX 组对细胞克隆数量减少的影响最大，其与单纯吉西他滨组相比较，差别有统计学意义(P<0.05)，（见图 2）。这提示 GSI-IX 除了可通过抑制细胞克隆途径抑制肿瘤生长，还可以提高吉西他滨对肿瘤细胞抑制作用的敏感性。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

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