Neuropilins在涎腺腺样囊性癌高血行转移中作用及普萘洛尔对腺样囊性癌的作用研究

发布时间：2020-05-15 23:56

【摘要】：涎腺腺样囊性癌(Salivary Adenoid Cystic Carcinoma,SACC)临床最常见的涎腺高发恶性肿瘤之一,具有嗜神经侵袭和高血行转移低淋巴结转移这两个显著的临床特点,肺是最常见SACC血行转移的靶器官。而其高血行转移是导致肿瘤复发和患者不良预后的重要原因,也是研究关注的焦点问题。肿瘤中血管的生成在肿瘤发展和转移的过程中起到了至关重要的作用。肿瘤中的血管是肿瘤细胞所需营养的输送渠道,也是肿瘤细胞转移的重要渠道,肿瘤中血管生成能力和微血管密度(micro vessels density,MVD)与肿瘤的血行转移正相关。Neuropilin蛋白家族是一类与肿瘤血管/淋巴管生成密切相关的跨膜细胞受体,不仅参与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为,其成员NRP1和NRP2分别参与调节肿瘤中血管或淋巴管的生成。但是,在SACC中,是否存在由于NRP1和NRP2表达差异而导致的血管淋巴管生成差异,进而导致SACC出现高血行转移低淋巴结转移的临床特点,未见报道。从2008年开始,普萘洛尔被发现具有抑制血管生成的作用,被用作临床治疗婴幼儿血管瘤的一线药物,具有安全性高,经济性好的特点。目前,也有少量有关普萘洛尔对某些肿瘤细胞作用的研究,提示,在体外,普萘洛尔可以抑制某些肿瘤细胞系,如胰腺癌等,细胞的增殖,促进其凋亡,但普萘洛尔对SACC是否具有上述效果未见报道。综上所述,本课题源自涎腺腺样囊性癌血行转移率高淋巴结转移率低这一临床特点,在正常涎腺组织(normal salivary gland,NSG)、口腔鳞状细胞癌组织(oral squamous cell carcinoma,OSCC)、发生血行转移SACC(metastatic SACC)以及未发生血行转移SACC(non-metastatic SACC)中对比研究NRP1、NRP2及其配体VEGF-A等与血管生成相关细胞因子的表达,微血管密度、微淋巴管密度(micro lymphatic vessels density,LVD)与蛋白表达和SACC血行转移的关系;研究普萘洛尔对SACC细胞的抑制作用以及对血管生成相关因子表达的抑制作用,为临床治疗SACC血行转移提供新的治疗策略和实验研究基础。研究目的:1、研究NRP1、NRP2及其配体VEGF-A等蛋白在正常涎腺组织、口腔鳞状细胞癌组织、发生血行转移SACC以及未发生血行转移SACC中的表达水平差异;研究上述组织中MVD和LVD的差异,并对NRP1及其配体VEGF-A等的表达强度与SACC组织和正常涎腺组织中MVD的关系进行了相关性分析研究。2、利用人涎腺腺样囊性癌细胞系SACC-83和人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞系SACC-LM,研究普萘洛尔对SACC细胞中NRP1、VEGF-A等血管生成相关因子和MMP-2以及MMP-9等与肿瘤细胞侵袭迁移运动相关因子的抑制作用;研究普萘洛尔对SACC细胞在迁移、侵袭等与转移相关的细胞生物学行为的影响;动物实验在体内研究普萘洛尔对SACC血行肺转移的影响。3、研究普萘洛尔对SACC-83和SACC-LM这两种SACC肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期和细胞自噬的影响;动物实验在体内研究普萘洛尔对SACC肿瘤形成和增殖的影响及对肿瘤内血管生成的影响。研究方法:1、收集正常涎腺组织、口腔鳞状细胞癌组织、发生血行转移SACC以及未发生血行转移SACC组织标本各30例,通过免疫组织化学染色和光密度法(mean IOD),观察对比NRP1、NRP2及其配体VEGF-A、Sema-3A和Sema-3F等蛋白在不同组织间的表达水平的差异;利用血管和淋巴管内皮标志物,对上述组织中的MVD和LVD进行计数统计;单因素方差分析用于研究不同组间蛋白表达的差异和组间MVD、LVD的差异;相关性检验用于研究MVD与目标蛋白表达之间的相互关系,综合所得结果分析SACC高血行转移可能的原因。2、对正常涎腺组织和SACC组织中β肾上腺素能受体进行免疫组织化学染色分析,主要研究其在SACC组织中的分布情况。研究不同浓度的普萘洛尔作用于SACC-83和SACC-LM细胞后,通过western blot实验研究细胞中NRP1、VEGF-A、MMP-2和MMP-9等与血管生成和细胞迁移侵袭相关的蛋白的表达变化;ELISA实验研究普萘洛尔对SACC肿瘤细胞分泌VEGF-A能力的影响;细胞划痕实验和Transwell侵袭实验研究细胞迁移、侵袭能力的变化;利用人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞系SACC-LM建立裸鼠SACC肺转移动物模型,研究普萘洛尔对SACC经血行肺转移的抑制作用。3、通过MTT实验研究普萘洛尔对SACC-83和SACC-LM细胞增殖能力的影响;流式细胞技术研究普萘洛尔对SACC-83和SACC-LM细胞凋亡和周期的影响;western blot实验观察普萘洛尔作用后细胞中自噬标志物的表达水平变化,研究普萘洛尔对细胞自噬的影响;利用SACC-LM细胞建立SACC裸鼠皮下移植瘤动物模型,研究在体内环境下普萘洛尔对SACC移植瘤形成及增殖的抑制作用,以及对肿瘤内血管生成的抑制作用。实验结果:1、在NSG、SACC、OSCC组织中,NRP1的NRP2表达具有明显差异:NRP1在SACC、OSCC在NSG中表达水平依次降低;NRP2在OSCC中表达最高,在NSG和SACC中无差别。MVD在SACC、OSCC和NSG中依次减少(p0.001)。OSCC中LVD最高,在NSG和SACC中LVD无差别。在转移SACC、未转移SACC和NSG中,NRP1、VEGF-A表达水平依次降低;NRP2的表达在三种组织间无差别;Sema-3A和Sema-3F的表达在三种组织间依次升高。MVD在转移SACC、未转移SACC和NSG中依次降低,组间差别具有统计学意义;LVD在三种组织间无差别。NRP1和VEGF-A在SACC-LM中表达均较SACC-83升高;而NRP2在SACC-LM中表达较SACC-83没有差别,无统计学意义。2、普萘洛尔作用于SACC-83和SACC-LM细胞后,两种细胞中的NRP1、VEGF-A、MMP-2和MMP-9表达随药物浓度的上升均下降,并且肿瘤细胞分泌VEGF-A的水平也有下降;细胞划痕实验和Transwell侵袭实验结果证明,SACC细胞的迁移和侵袭能力随普萘洛尔浓度的升高而降低;裸鼠肺转移实验结果发现,普萘洛尔作用组中,SACC肺转移的转移灶少,且转移灶的体积也较小,证明普萘洛尔可以抑制SACC细胞的经血行肺转移。3、普萘洛尔作用于SACC-83和SACC-LM细胞后,两种细胞的增殖随药物浓度的上升和作用时间的延长受到明显的抑制;细胞周期实验发现普萘洛尔作用后,两种细胞S期延长,G0/G1期缩短,符合增殖抑制的表现。普萘洛尔作用后均促进了SACC-83和SACC-LM细胞的凋亡和自噬,作用效果与药物浓度和作用时间正相关。动物实验发现,普萘洛尔作用后,SACC移植瘤重量显著小于对照组。进一步研究发现,在移植瘤中,普萘洛尔作用组MVD虽然与对照组MVD没有差别,但普萘洛尔作用组的血管直径要明显小于对照组,且差异具有统计学意义。实验结论:涎腺腺样囊性癌中NRP1和VEGF-A的表达升高导致了血管生成的增加,为其血行转移提供了必要条件;NRP2的低水平表达抑制了肿瘤中淋巴管的生成,阻断了肿瘤沿淋巴管转移的通道,降低了肿瘤发生淋巴结转移的可能。上述原因可能是导致涎腺腺样囊性癌高血行转移低淋巴转移的原因之一。普萘洛尔可以通过抑制SACC细胞表面NRP1的表达以及肿瘤细胞中VEGF-A的合成与分泌,抑制SACC组织中新生血管的形成和发育,并通过抑制SACC细胞中MMP-2和MMP-9的表达,抑制了肿瘤细胞的运动和侵袭能力,同时,普萘洛尔还具有停滞肿瘤细胞周期、促进肿瘤细胞发生凋亡和自噬,从而抑制细胞增殖的能力。综上所述,对于SACC,普萘洛尔从肿瘤中血管生成和肿瘤增殖及运动等多方面抑制了SACC的发展和血行转移。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.8

【参考文献】