天然药物苦参碱和四氟对苯醌在治疗甲状腺癌中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-16 01:38

【摘要】：背景:在全世界范围内,癌症是一个比较突出公共卫生问题,我国主要的恶性肿瘤主要是甲状腺癌、胃癌、肺癌等其他十余种癌症类疾病,在全部新发病例中约占75%。其中最常见的内分泌恶性肿瘤是甲状腺癌,每年发病率都在不断的增长。甲状腺癌的发病机制尚没有完全阐明,例如碘的摄入、遗传因素、放射线接触、其他如性激素等都可能与甲状腺癌的发生有关,已经严重影响到了人类健康安全,特别是对于女性来说,越来越成为影响健康的恶性肿瘤类疾病,能够寻找到并采取积极正确而有效的治疗方案已成为当务之急。甲状腺癌有四种组织学类型,乳头状甲状腺癌和滤泡性甲状腺癌为分化型甲状腺癌,约占甲状腺恶性肿瘤90%以上。分化型甲状腺癌一般可以治愈的,较为常见。未分化甲状腺癌恶性程度最高,且死亡率极高。因此,对于甲状腺癌的发病机制进行深入的探讨和研究,有助于我们能够对于甲状腺癌进行更早的诊断,以及根据发病机制而开发的更加全面而有效的治疗新方案,从而以期进一步改善甲状腺癌患者的生活质量,最终达到较稳定和优良的预后随访结果,降低甲状腺癌类疾病的死亡率。对于大多数肿瘤来说基因的突变对于肿瘤的发生和发展至关重要,基因与肿瘤的关系是通过细胞内部的相关分子信号通路对于细胞产生作用,影响功能蛋白分子发生改变,使得细胞的增殖发生变化,细胞的生物学特性及形态学改变,最终产生肿瘤。研究表明mi R-21参与多种肿瘤的发生和生长。抑癌基因磷酸酶与张力蛋白同源物基因(PTEN)通过Akt去磷酸化抑制肿瘤,而PTEN是mi R-21的靶基因。许多学者进行的现代药理实验证据表明,天然药物苦参碱具有常见的抗病毒、抗炎、抗心律失常等作用,同时具有很强的抑制肿瘤发生的作用,研究表明苦参碱可抑制肿瘤细胞的增生,临床上苦参碱对肝癌、胃癌以及白血病都有良好的临床治疗效果,同时苦参碱成分的毒副作用弱,故经过研究,在未来很有可能应用其抗癌的良好作用,制成具有很好抗癌效果的植物活性药物,可能是治疗人甲状腺癌乳头状细胞(Thyroid papillary carcinoma-1,TPC-1)的一种有前景的替代药物。甲状腺未分化癌(Anaplastic thyroid carcinoma,ATC)靶向治疗最有效的药物类别是紫杉醇(紫杉醇或多西紫杉醇)、蒽醌类、苯醌类和铂类(顺铂或卡铂)。天然产品苯醌类化合物--四氟对苯醌具有很好的抗肿瘤活性和毒性很低。作用机制涉及醌氧自由基的产生,参与重要的细胞过程的分子的甲基化、DNA等作用。目的:本研究旨在探讨苦参碱对TPC-1细胞的治疗作用及潜在分子机制。研究苦参碱对体外培养的TPC-1细胞增殖和细胞周期的影响,以及苦参碱对TPC-1细胞中mi R-21和靶基因PTEN/Akt通路表达的影响。探讨四氟对苯醌在体内和体外对ATC影响。为苦参碱和四氟对苯醌治疗甲状腺癌进一步研究,提供实验室依据和理论基础,探索苦参碱和四氟对苯醌治疗甲状腺癌的应用前景,为治疗甲状腺癌的药物开发提供新的研究思路。方法:(1)MTT法检测苦参碱对TPC-1细胞生存率的影响。(2)q RT-PCR检测苦参碱作用TPC-1细胞,micro RNA-21基因表达变化。(3)分别转染micro RNA-21 mimics质粒和micro RNA-21 inhibitor质粒,Annexin V-PI检测细胞凋亡变化;(4)Western blot方法检测线粒体凋亡相关蛋白PTEN蛋白、Akt蛋白的变化。(5)用MTT法分析了HOTHC和ATC细胞系的生长情况。(6)Western blot对蛋白带进行定量及DAPI染色细胞的核分裂分析。(7)分析HOTHC细胞的小管形成趋势及测定HOTHC细胞迁移。(8)裸鼠模型实验测定肿瘤体积和重量,以测定肿瘤生长抑制率。结果:(1)MTT法测定苦参碱在浓度和时间上抑制TPC-1细胞的生长,最高可达95.8%(20 mg/ml的苦参碱),其IC50为3.54 mg/ml,48 h。(2)用FITC-A/PI双染色和流式细胞术检测TPC-1甲状腺癌细胞凋亡。苦参碱诱导TPC-1细胞凋亡显著。发现M0对照组在G1期51.36±2.07%,在S期23.37±3.25%和G2/M期18.49±2.46%。与苦参碱TPC-1细胞治疗后10 mg/ml 48h,在G1期细胞比例增加到74.49±3.65%,在S期下降到2.42±1.63%。在G2/M相中,未观察到细胞百分比的显著变化。这些结果表明,在甲状腺癌细胞的G1/S期,苦参碱诱导细胞周期阻滞。(3)mi R-21的水平是由实时qPCR测定,TPC-1细胞用苦参碱0、2、5mg/ml(M0,M2和M5)处理后48 h。苦参碱处理的TPC-1细胞,mi R-21明显降低。PTEN结果上调M5/M0增加到1.66倍,M2/M0增加到1.21倍。Akt水平降低M5/M0为0.34倍和M2/M0为0.61倍。实验表明,使用苦参碱治疗的TPC-1细胞的mi R-21水平被下调,随后,其目标PTEN在m RNA和蛋白水平均升高,Akt水平降低。另一方面,mi R-21模拟序列被转染到TPC-1细胞中,发现mi R-21的过度表达下调了PTEN蛋白水平。这些结果表明,苦参碱可以调节mi R-21来改善PTEN抑制TPC-1甲状腺癌细胞。(4)Western blotting检测PTEN蛋白和磷酸化Akt(p Akt)蛋白水平。与M0对照相比,PTEN在苦参碱上显著上调(M5/M0 1.64倍,M2/M0 1.21倍)。p Akt的水平被下调(M2/M0为0.61倍,M5/M0为0.24倍)。mi R-21 mimic显著降低了PTEN蛋白(与M0 blot的比值),并将p Akt增加到1.24倍(比M0 blot值)。这些结果阐明了苦参碱调控mi R-21/PTEN/Akt通路诱导TPC-1细胞凋亡和周期阻滞。(5)MTT实验结果表明,在四氟对苯醌治疗48小时内,HOTHC和ATC细胞系的生长显著下降。使细胞的生长从98%减少到17%,细胞生长速率分别为96%和21%。(6)HOTHC细胞凋亡。Western blot分析显示在HOTHC细胞系中Bcl-2的表达明显减少。DAPI染色结果显示,在四氟对苯醌治疗HOTHC细胞中,DNA的分裂和核细胞凋亡的存在。(7)用四氟对苯醌对HOTHC细胞的治疗后,导致了对低氧诱导因子-1(HIF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的抑制。(8)在使用四氟对苯醌的治疗中,HOTHC细胞的血管生成能力和迁移潜力均受到抑制。(9)四氟对苯醌治疗在小鼠异种移植模型体内抑制肿瘤生长。结论:(1)苦参碱抑制TPC-1人甲状腺癌乳头状细胞增殖,诱导细胞凋亡和周期阻滞;(2)苦参碱下调TPC-1人甲状腺癌乳头状细胞中mi R-21表达量;诱导PTEN上调,p Akt信号下调;(3)mi R-21/PTEN/Akt通路可能是苦参碱抑制TPC-1甲状腺癌细胞的机制之一。(4)在四氟对苯醌治疗HOTHC和ATC细胞系的生长显著下降,B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)的表达明显减少,Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和细胞凋亡的标志蛋白PARP降解产物(cleaved-PARP)的表达细胞增加。(5)对HOTHC细胞的治疗导致了对HIF-1和VEGF表达的抑制,HOTHC细胞的血管生成能力和迁移潜力均受到抑制。(6)四氟对苯醌治疗裸鼠肿瘤体积和重量显著下降。(7)苦参碱和四氟对苯醌可以成为治疗甲状腺癌的有效替代药物。
【图文】：

遗传改变,治疗靶点,甲状腺癌,信号通路

图 1：MAPK 和 PI3K- Akt -MTR 通路在甲状腺癌中的遗传改变和治疗靶点。右侧显示MAPK 信号通路，左侧显示 PI3K- Akt -mTOR 通路。MAPK 通路中的突变包括 RT-PTC重排、RAS 突变和 BRAF 突变。PI3K 通路中常见的遗传改变包括 RAS 突变、PTEN 突变或缺失，PIK3CA 突变或扩增，Akt1 突变[91]。在许多不同类型的肿瘤组织、移植瘤、肿瘤细胞系和多种进展期肿瘤组织（如脑肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、甲状腺癌及非小细胞肺癌）中存在着不同程度的突变或丢失的PTEN 基因；此种改变可作为脂质磷酸酶，，负性调控 P13K-Akt 通路，促进细胞增殖和凋亡；也可作为蛋白磷酸脂酶，抑制 MAPK 信号通路[92]。PTEN 作为抑癌基因之一，其发生突变或者缺失导致PI3K-Akt 信号通路激活，在绝大多数的肿瘤发生过程中，扮演着重

苦参碱,浓度,靶向治疗,细胞

第 2 章苦参碱对分化型甲状腺癌靶向治疗应用研究结果1 苦参碱对 TPC-1 细胞增殖的影响MTT 法测定细胞在 0、1、2、5、10、20 mg/ml、24h、48h、7情况下，对甲状腺癌细胞 TPC-1 的生长情况进行测定。苦参碱 TPC-1 细胞在浓度和时间上的生长，其 IC50 为 3.54 mg/ml, 48 1）。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R736.1

【参考文献】