甘露聚糖结合凝集素在肝细胞肝癌与四氯化碳诱导的急性肝损伤发生发展中的作用研究

发布时间：2020-05-18 11:32

【摘要】：甘露聚糖结合凝集素(Mannan-binding lectin,MBL)是一种可溶性的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),为C型凝集素超家族中胶凝素(collectins)的一员。MBL主要由肝细胞合成,作为糖蛋白存在于血浆中。MBL在天然免疫及免疫调节中起重要作用。近来的临床资料表明MBL表达水平及其编码基因(MBL2)的多态性与多种肝脏疾病密切相关,如急性肝衰竭、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、肝癌等。但是MBL在这些疾病中的具体作用机制尚不清楚。在本文研究中,我们选用了 MBL基因敲除小鼠(MBL-I-),探讨MBL在肝细胞肝癌、四氯化碳诱导的急性肝损伤中的作用及机制,对相关疾病的治疗研究具有一定的指导意义。第一章甘露聚糖结合凝集素在肝细胞肝癌发生发展中的作用研究目的:研究MBL在原发性肝细胞肝癌发生发展中的作用,并探讨其作用机制。方法:采用高压尾静脉注射Hepal-6肝癌细胞的方法分别在MBL-/-小鼠及相应的野生型(WT)小鼠中建立肝癌模型,21天后处死小鼠,观察肝脏内肿瘤结节的情况;体外用MBL处理肝癌细胞,CCK8实验检测细胞活力,流式检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞迁移;分离小鼠肝脏白细胞,流式细胞分析术检测肝脏内骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)、调节T细胞(Tregs)和CD8+IFN-γ+T的比例;进一步利用免疫组化确认肝脏肿瘤内MDSCs的分布情况;用免疫荧光法检测MBL2与MDSCs、MBL2与肝星状细胞(HSCs)的共定位情况;使用免疫组化、Western blot、RT-PCR检测HSCs的活化;ELISA检测肝脏肿瘤组织研磨液中前列腺素E2(PGE2)的含量,并进一步利用免疫荧光法探索产生PGE2的主要细胞;并用免疫组化、Western blot、RT-PCR检测肝脏肿瘤内环氧合酶2(COX2)的转录及表达情况,同样用免疫荧光验证表达COX2的主要细胞。最后将pAAV-MBL2通过尾静脉注射入小鼠体内,3周后注射肝癌细胞建立肝癌模型,成模后检测上述指标,进一步验证MBL在肝细胞肝癌中的作用。20%的HeG2-CM刺激LX2细胞,加入MBL处理,WB和RT-PCR的结果检测LX2细胞上α-SMA和COX2的表达,ELISA检测LX2细胞培养上清中PGE2的含量。结果:I.MBL缺陷能促进肝细胞肝癌的发生发展。2.MBL处理不直接影响肝癌细胞的增殖、凋亡和迁移。3.MBL缺陷影响肿瘤微环境中MDSCs、Tregs和CD8+IFN-γ+T的比例。4.MBL缺陷影响aHSCs上COX2-PGE2轴。5.注射pAAV-MBL2后,MBL-/-小鼠中肝细胞肝癌的发生发展明显受到抑制。6.MBL抑制人肝星状细胞系LX2细胞的活化。结论:在肝脏肿瘤微环境中,MBL主要通过影响aHSCs上COX2-PGE2轴,从而影响肝癌肿瘤微环境。这些结果提示MBL影响肝癌肿瘤微环境的机制,为MBL缺陷肝细胞肝癌患者的免疫治疗,提供了新的切入点。第二章 甘露聚糖结合凝集素在四氯化碳诱导的急性肝损伤发生发展中的作用研究目的:研究MBL在四氯化碳诱导的急性肝损伤发生发展中的作用及其作用机制。方法:采用腹腔注射CCl(1 ul/g体重)的方法分别在MBL-/-小鼠及相应的野生型(WT)小鼠中建立急性肝损伤模型,24h处死小鼠,收集小鼠血清及分离小鼠肝脏进行实验。ELISA检测小鼠血清中ALT、LDH的活性和炎性细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β的水平;分离小鼠肝组织,HE染色观察肝组织病变,TUNEL染色分析肝细胞坏死情况,RT-PCR检测肝脏炎性细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β的水平;WB及RT-PCR检测CYP2E1的转录及表达;流式细胞术及免疫组化分析肝脏中巨噬细胞、中性粒细胞浸润情况;用抗Ly6G抗体中和中性粒细胞后,观察肝损伤情况;RT-PCR研究趋化因子CXCL1、CXCL2的变化,并用WB、RT-PCR及免疫荧光法检测肝脏巨噬细胞上CXCL2的表达情况。用氯磷酸盐脂质体清除巨噬细胞后,观察肝损伤情况。最后将pAAV-MBL2通过尾静脉注射入小鼠体内,3周后建立急性肝损伤模型,进一步验证MBL在急性肝损伤中的作用。结果:I.MBL缺陷加剧CC14诱导的肝损伤。2.MBL缺陷加剧CC14诱导的肝损伤并非由CC14的代谢所引起。3.MBL缺陷加剧CCl4诱导的肝损伤主要是由于中性粒细胞浸润增多。4.中性粒细胞浸润增多主要是通过诱导巨噬细胞上CXCL2的表达。5.MBL缺陷加剧CC14诱导的肝损伤的机制是由巨噬细胞介导。6.注射pAAV-MBL2后,MBL-/-小鼠肝损伤明显改善。结论:MBL主要通过影响巨噬细胞的功能,抑制其产生趋化因子,减弱中性粒细胞向肝脏的浸润,从而改善肝损伤。这些结果揭示了 MBL在肝损伤发生中的免疫作用,这对相关疾病的治疗具有一定的指导意义。
【图文】：

逑刺激４８邋ｈ后ａＨＳＣｓ蛋白，以肝组织蛋白作为对照，检测ＨＳＣ上是否有ＭＢＬ２逡逑的表达。结果显示，不管ｑＨＳＣｓ，还是ａＨＳＣｓ均无ＭＢＬ２蛋白的表达（图１－５Ｃ）。逡逑而且ｑＨＳＣｓ、ａＨＳＣｓ上均无ＭＢＬ２基因的转录（图１－５Ｄ）。以上结果表明肝星逡逑状细胞不能产生ＭＢＬ，但可与ＭＢＬ直接接触从而发挥作用。逡逑首先我们检测了肿瘤负荷小鼠肝脏中ＨＳＣｓ的活化，免疫组化、ＲＴ－ＰＣＲ和逡逑ＷＢ结果均显示，ＭＢｌ／ｖｊ、鼠肝脏肿瘤中ａ－ＳＭＡ的表达明显高于ＷＴ小鼠（图逡逑１－６Ａ－Ｄ）。既然己经确定ＭＢＬ可能通过ＨＳＣｓ影口向ＭＤＳＣｓ的浸润，那是如何逡逑影响的呢。在肝癌中，ａＨＳＣｓ可以产生粒细胞巨噬细胞刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、逡逑粒细胞刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、白介素－６邋（ＩＬ－６）、血小板源性生长因子（ＰＤＧＦ）逡逑诱导ＭＤＳＣｓ，但己有研究指出这些并非是诱导ＭＤＳＣｓ的主要因子｜４１，４２】。Ｙａｐｉｎｇ逡逑Ｘｕ等的研究表明，ａＨＳＣｓ产生的ＰＧＥ２可以诱导ＭＤＳＣｓ，主要是通过合成ＰＧＥ２逡逑的限速酶ＣＯＸ２１４３１。通过ＥＬＩＳＡ方法

？逦？逦？逦＾逦＇邋Ｉ邋■逡逑＇Ｎ．．．邋．．．逡逑图２－４使用抗Ｌｙ６Ｇ抗体中和小鼠肝脏中性粒细胞逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－４邋Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ邋ｉｎ邋ｖｉｖｏ邋ｂｙ邋ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｎｔｉ－Ｌｙ６Ｇ逡逑Ａｂ逡逑（Ａ）邋Ｔｏ邋ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ邋ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｒｅｃｅｉｖｅｄ邋ａｎ邋ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋１００邋ｊｉｇ邋ａｎｔｉ－Ｌｙ６Ｇ逡逑Ａｂ邋ｏｒ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ａｂ，，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，邋６邋ｈ邋ａｆｔｅｒ邋ＣＣＩ４邋ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ．邋（Ｂ）邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ逡逑Ｌｙ６Ｇ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｆ邋ｌｉｖｅｒｓ邋ａｆｔｅｒ邋ａｎｔｉ－Ｌｙ６Ｇ邋Ａｂ邋ｏｒ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ａｂ邋ｔｒｅａｔｅｄ．Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒｓ，邋５０邋ｊｉｍ．逡逑５０逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7;R575

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本文编号：2669650