抑制蛋白激酶CK2α对顺铂在非小细胞肺癌化疗中增敏作用的机制研究

发布时间：2020-05-18 12:42

【摘要】：研究背景NSCLC是一种恶性程度较高的肺部肿瘤,它的侵袭性较强,预后较差,而在所有的肺癌中,NSCLC的比例约为80%。对于NSCLC,最主要的治疗为根治性的手术切除,然而由于缺乏早期特异性的诊断方法,在确诊之后有很多的患者已经失去了手术时机。化疗在NSCLC的治疗策略中仍占据着不可撼动的地位,约60%的患者化疗是有效的[2,3],然而化疗的疗效不是特别显著[4,5]。因此,找到方法从根本上提高化疗的疗效从而提升NSCLC患者的无瘤生存期有着重要的意义。以CDDP为基础的系统性及辅助性化疗是NSCLC药物治疗的主要手段[6],甚至有时可以达到根治程度。但是,在使用CDDP化疗时,肿瘤细胞本身固有的和/或化疗后期出现的对CDDP药物的抵抗极大程度的降低了治疗效果,而CDDP耐药的分子机制引发了我们的思考,因此化疗增敏让我们产生了极大的兴趣。CK2是一种在哺乳动物细胞内大量存在的第二信使非依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[7],为一四聚体异构而成的全酶,它包含两个催化亚基:α和/或α,;两个调节亚基:β。其中CK2α在其中起到主要作用,特别在NSCLC中CK2α较其他亚基有着明显的过表达,且CK2α具有癌基因的致癌效应,并与细胞的存活、凋亡、侵袭、迁移能力存在密切关系,这强调了CK2α与NSCLC肿瘤发生、发展及预后的相关性。同时还有报道表明CK2α在肺癌组织、细胞中扮演着重要的角色,甚至可能成为NSCLC化学药物治疗的潜在靶点,但是其具体机制尚未明确[12]。那么对于CK2α在NSCLC的化疗中所起到的作用及其机制的研究就变得尤为重要了。目的本研究旨在探讨CK2α的表达与NSCLC病人的临床指标及预后生存关系,分析CK2α在CDDP介导的NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡中的作用及其可能的分子机制,由此来探索对NSCLC的联合用药治疗,提高CDDP的化疗疗效,从而达到化疗增敏。方法:1.在国际生物信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索确认CK2α基因名称:CSNK2A1,从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA,http://ualcan.path.uab.edu/index.html)数据库中搜索CSNK2A1所对应的数据,从中查找CSNK2A1在NSCLC与正常组织中的表达差异情况。2.本研究选取了经术后病理证实为NSCLC的病人60例,非恶性肺部肿瘤病人40例,应用免疫组织化学检测60例NSCLC癌组织、癌旁组织和40例非恶性肺部肿瘤组织中CK2α的表达,分析CK2α的表达情况与病人临床一般资料的关系。3.从基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库中下载GSE42127芯片数据,样本总共176例原发性NSCLC肿瘤组织样本,从中找到CSNK2A1对应探针的表达数据,根据CK2α表达水平,结合病人生存时间数据,绘制生存曲线。4.通过MTT法检测CDDP时间和浓度梯度对NSCLC细胞增殖率的影响;流式细胞术(Annexin V-FITC和PI双染)检测CDDP浓度梯度对NSCLC细胞凋亡的影响;通过Western blot法检测CDDP对NSCLC细胞内Cleaved caspase-3、Cytochrome C凋亡相关蛋白表达水平的影响及CDDP浓度梯度对NSCLC细胞内CK2α蛋白表达水平的影响。5.通过MTT法、平板克隆实验、Transwell侵袭实验、流式细胞术Rhodamine123染色法、Western blot法检测通过抑制CK2α对CDDP作用下的NSCLC细胞的增殖、侵袭、迁移能力、细胞线粒体膜电位及细胞内凋亡相关蛋白的影响。6.通过Western blot法检测p38 MAPK特异性抑制剂对CDDP诱导NSCLC细胞凋亡的p38 MAPK信号通路关键串联蛋白表达水平的影响,通过Western blot法检测CK2α抑制剂和si RNA基因沉默CK2α基因对CDDP诱导NSCLC细胞中PML蛋白表达水平的影响,通过Hochest染色法及免疫荧光观察CK2α抑制剂对CDDP诱导NSCLC细胞内Honest和早幼粒细胞白血病基因(promyelocytic leukemia gene,PML)蛋白表达水平的影响。以此探讨抑制CK2α增强CDDP诱导NSCLC细胞凋亡的作用机制。7.通过裸鼠皮下移植NSCLC瘤模型检测CK2α抑制剂对CDDP诱导体内NSCLC肿瘤生长抑制作用的影响。8.实验所得数据均经过三次以上实验重复验证,数据以均数±标准差((?)±SD)形式表示,所得相关数据使用SPASS Statistics 19.0统计软件进行数据录入及分析,相关影像学统计使用仪器配套软件进行分析,计数数据采用X2检验,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,并对曲线进行logrank检验,不同实验组之间的数据对比,使用ANOVA进行分析,p0.05表示存在统计学差异,P0.01表示存在显著的统计学差异。结果:1.TCGA数据库中,CSNK2A1所对应的数据显示CK2α在肺腺癌(P0.05)、鳞癌(P0.05)组织中的阳性表达率显著高于正常组织。2.免疫组化结果显示CK2α在NSCLC组织、癌旁组织和非恶性肺部肿瘤组织中的阳性率分别为61.7%、11.7%和22.5%,在NSCLC组织中的表达率显著高于癌旁组织(61.7%vs11.7%;P0.05),也高于非恶性肺部肿瘤组织(61.7%vs22.5%;P0.05)。3.统计分析结果显示CK2α的阳性表达率及表达强度与患者的年龄、性别、病理类型、淋巴结转移与否及肿瘤的TNM分期无关(P0.05),但与NSCLC组织的病理分化程度具有显著相关性(P0.05)。4.Kaplan-Meier曲线生存分析结果显示,CK2α低表达者生存期较长,高表达者生存期较短(P0.05)。5.MTT法检测NSCLC细胞增殖结果显示:CDDP能够抑制H157、A549、H226细胞的增殖活性,并且在一定的范围内,CDDP对NSCLC细胞增殖的抑制呈现出浓度和时间的依赖性。6.流式细胞术结果显示:随着CDDP浓度的增加,H157、A549、H226细胞的早期凋亡率随之增加。Western blot法检测结果显示:随着CDDP作用浓度和时间的增加,NSCLC细胞中Cleaved caspase-3、Cytochrome C蛋白表达水平逐渐增高。7.Western blot法检测结果显示:随着CDDP浓度的增加,NSCLC细胞中CK2α蛋白表达水平逐渐增高。8.MTT法检测结果显示:在CK2α抑制剂作用下,CDDP对NSCLC细胞的增殖抑制作用增强;平板克隆实验结果显示:CK2α抑制剂可进一步显著增强CDDP对NSCLC细胞集落形成的抑制。9.Transwell侵袭实验结果显示:CK2α抑制剂可增强CDDP对NSCLC细胞侵袭、迁移能力的抑制。10.流式细胞术Rhodamine 123染色法检测结果显示:CK2α抑制剂可进一步增强CDDP对NSCLC细胞线粒体膜电位水平的下调作用。CK2α抑制剂和si RNA基因沉默CK2α基因增强了CDDP诱导的NSCLC细胞中凋亡相关蛋白的表达水平。11.抑制CK2α增强CDDP诱导NSCLC细胞凋亡的作用机制:CDDP激活了p38 MAPK信号通路,使得p38 MAPK磷酸化,p38 MAPK磷酸化后进一步激活CK2α,CK2α使得PML磷酸化增多,这种磷酸化的发生导致了蛋白酶介导的多聚泛素化的PML降解,从而导致了PML下调。而抑制CK2α,PML的磷酸化减少,蓄积增多,从而增强了CDDP对NSCLC细胞的凋亡效应。12.裸鼠皮下移植瘤实验结果显示:与生理盐水对照组相比,TBB给药组的生长抑制不明显,CDDP给药组和CDDP联合TBB给药组的肿瘤体积和重量抑制率增高,而且CDDP联合TBB给药较CDDP单独给药,对肿瘤的生长抑制更加明显。Western blot法检测肿瘤组织胞浆内相关蛋白结果显示:CDDP联合TBB组的Cleaved caspase-3和Cytochrome C的表达水平较TBB组、CDDP组升高,CDDP联合TBB组的CK2α的表达水平较CDDP组降低,而PML的表达水平较CDDP组升高,结果与体外实验相一致。结论:1.在临床相关研究中证实了CK2α在NSCLC组织中过表达,并在研究过程中发现了CK2α表达水平与NSCLC组织病理分化程度相关,推测CK2α可能与NSCLC的发生、发展过程相关,CK2α的表达强度检测可作为判定NSCLC恶性程度的潜在指标之一。2.蛋白激酶CK2α的过表达可能与NSCLC患者的预后相关,可作为NSCLC患者的一项不良愈后指标。3.联合使用CDDP和CK2αsi RNA或者CDDP和CK2α抑制剂在抑制NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移和促进NSCLC细胞凋亡方面比单独使用CDDP更加有效。4.抑制蛋白激酶CK2α使CDDP在NSCLC化疗中增敏的作用机制:CDDP激活了p38MAPK信号通路,使得p38MAPK磷酸化,p38MAPK磷酸化后进一步激活CK2α,CK2α使得PML磷酸化增多,这种磷酸化的发生导致了蛋白酶介导的多聚泛素化的PML降解,从而导致了PML下调。而抑制CK2α,PML的磷酸化减少,蓄积增多,从而增强了CDDP对NSCLC细胞的凋亡效应,达到化疗增敏。5.CK2α可能成为NSCLC分子治疗的潜在靶点,对CK2α抑制剂的研究和应用对NSCLC的治疗具有深远的临床意义。
【图文】：

机制,患者,化学药物治疗,药物疗效

第 1 章综述起 DNA 损伤并且干扰 DNA 修复（如图 1.1）[85]。而对于晚期 NSCLC 患者要化疗诱导/辅助治疗的早、中期 NSCLC 患者，CDDP 是最为有效的铂剂[8.6.3.2 CDDP 在 NSCLC 化学药物治疗中的耐药机制以 CDDP 为基础的化疗在 NSCLC 的治疗过程中，随着治疗的进展，CD药物疗效逐渐下降，在一项关于CDDP在NSCLC新辅助化疗中疗效的实验完全反应率只有大约 10%[87]，这反映了从一开始或后期获得的对 CDDP 化耐药，而 CDDP 在 NSCLC 治疗中的耐药现象正是改善患者长期疗效的最主碍之一[88]。

耐药机制

图 1.2 CDDP 的主要耐药机制[90]Figure 1.2 Major mechanisms of tumour resistance to CDDPCisplatin enters cells either by transporters, such as the copper transporter CTR1, by passive diffusion. A loss of CTR1 results in less platinum entering the cells antherefore, in resistance. Enzymatic inactivation of cisplatin by metallothioneins anglutathione-related metabolism enzymes, such as glutathione transferase, have alsbeen described in some platinum-resistant cancer cells.DNA 修复路径主要包含 4 条：核苷酸切除修复（nucleotide-excision repair，NER）、碱基切除修复（base-excision repair，BER）、错配修复（mismatch repairMMR）和双链断裂修复（double-strand-break repair，DSBR）。乳腺癌 1 号（breacancer 1，BRCA1）可通过 NER 或是 DSBR 参与 DNA 修复或通过调控其他修复因子的表达水平从而介导 DNA 损伤修复。有文献报道，，CDDP 耐药的 NSCL细胞株中，BRCA1 蛋白水平升高，而通过抑制 BRCA1 的表达，NSCLC 细胞对
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

【参考文献】