蛋白纳米粒的仿生合成及其在肿瘤诊断与治疗中的应用

发布时间：2020-05-19 13:40

【摘要】：恶性肿瘤严重威胁人类的生命健康。因此,如何实现肿瘤的高效诊断和治疗是当前面临的巨大挑战。近年来,纳米材料领域的飞速发展为肿瘤的诊断与治疗带来新的契机。其中,基于蛋白质的纳米材料因其生物相容性好、制备工艺简单等特点受到广泛关注。影像探针或治疗用药可通过静电吸附或共价偶联等方式整合进蛋白质制得蛋白纳米粒,可有效提高药物负载量、提升药物稳定性、延长药物体内循环时间,显著提升肿瘤成像与治疗效果。然而,使用这些方法制备的蛋白纳米粒尺寸无法得到精确控制,由于尺寸分布较宽且易聚集等特点,巨噬系统对其摄取量高,从而降低肿瘤部位蓄积量,难以满足肿瘤的高效诊疗。因此,如何在温和条件下实现蛋白纳米粒的可控合成是蛋白纳米材料用于肿瘤高效诊疗中亟待解决的关键问题。基于蛋白纳米反应器的仿生合成法是近年来快速发展的一种新型无机纳米粒合成方法,其原理是模拟蛋白质内部空腔中的生物矿化作用,通过蛋白质分子中氨基酸残基与金属离子相互作用(如静电吸附、配位等)形成成核中心,在还原反应、无机沉淀反应等作用下,诱导无机纳米晶在其内腔中成核、生长,形成包载无机纳米晶的蛋白纳米粒。该方法具有粒径可控、反应条件温和、制备工艺简单等特点,可有效提升蛋白纳米粒在肿瘤部位的蓄积量,提高肿瘤成像与治疗效果,实现肿瘤精确诊断与高效治疗,显示出良好的生物应用前景。本论文首先通过人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)纳米反应器仿生合成法,制得尺寸可控的载硫化银白蛋白纳米粒(Ag2S@HSA),用于肿瘤部位超灵敏、高分辨的近红外二区荧光、光声双模式成像,同时利用其光热效应,实现高效的肿瘤光热治疗。此外,为解决深部肿瘤解剖学成像对比度不足的问题,我们以肿瘤靶向性转铁蛋白(transferrin,Trf)作为纳米反应器,构建载四氧化三锰转铁蛋白纳米粒(Mn3O4@Trf),用于肿瘤微环境响应性磁共振成像,实现深部肿瘤的高对比度解剖学成像,提高诊断准确性。本论文具体研究内容概述如下:第一章:简述近年来蛋白纳米粒的发展历程,以及蛋白纳米粒在纳米医药领域的研究现状,并在此基础上阐明了本论文的立题依据及研究内容。第二章:以白蛋白作为纳米反应器诱导硫化银在蛋白内腔中可控生长,制备载硫化银白蛋白纳米粒(Ag2S@HSA),并探索其在肿瘤诊疗一体化中的应用。人血清白蛋白作为纳米反应器可在温和条件下诱导Ag2S纳米晶在白蛋白内腔中成核、生长,并通过控制反应时间和原料反应比,实现Ag2S@HSA粒径的精确调控。利用吸收光谱对其生长过程进行监测,发现该过程属于扩散控制的生长动力学行为。在近红外激光照射下,Ag2S@HSA具有尺寸依赖的近红外二区荧光信号及光热效应,且光稳定性良好。Ag2S@HSA可被4T1细胞通过网格蛋白介导的内吞途径摄取,并定位于酸性细胞器溶酶体,光照后对细胞可产生显著杀伤作用。Ag2S@HSA在小鼠体内血液循环时间较长(t1/2β=5.7 h),显示出良好的肿瘤靶向性,并能长期滞留于肿瘤部位。在50μmolkg-1注射剂量下,Ag2S@HSA在4T1皮下瘤动物模型中可实现超灵敏、空间分辨显著的近红外二区荧光和光声双模式成像。在近红外激光激发下,单次光热治疗即可完全消除肿瘤,且对正常组织无明显损伤。此外,Ag2S@HSA具有良好的体内安全性,可在注射后30天从体内清除,避免长期蓄积带来的潜在毒性。第三章:以肿瘤靶向性转铁蛋白作为纳米反应器诱导四氧化三锰在其空腔中成核生长,制得载四氧化三锰转铁蛋白纳米粒(Mn304@Trf),并探索其在肿瘤微环境响应性磁共振成像中的应用。利用转铁蛋白与高锰酸钾发生的氧化还原反应,诱导四氧化三锰纳米晶在蛋白空腔中成核、生长,在温和条件下制得Mn304@Trf,并通过控制反应时间,实现了 Mn304@Trf的可控生长。Mn304@Trf结晶性良好,但仍存在晶格缺陷,该缺陷使其在酸性及还原性环境中大量释放Mn2+,有效提高局部Mn2+浓度,从而大幅提升磁共振造影性能。Mn304@Trf与pH 5.0缓冲溶液共孵育24 h后,其纵向弛豫系数(r1)由0.34mM-1s-1提升至3.2mM-1s-1;还原性环境的协同作用促进了更多的Mn2+释放,从而使其ri进一步增加至7.2mM-1s-1,显示出酸性、还原性双重响应的磁共振信号增强效应。Mn304@Trf具有较长的血液循环时间(t1/2β = 4.5h),通过与转铁蛋白受体(TfR1)的相互作用,能高效蓄积于高表达TfR1的人结肠癌(HT-29)皮下移植瘤,并渗透至肿瘤深部,显示出尺寸依赖的靶向行为。内吞进入溶酶体后,Mn304@Trf在酸性和还原性环境刺激下,将皮下移植瘤和原位肿瘤的磁共振造影信噪比提高至200～250%。此外,在肿瘤瘤内局部注射酸性或还原性溶液后,Mn304@Trf可将肿瘤部位的信噪比进一步提高至400%,产生了高对比度的磁共振成像效果。上述研究表明,Mn304@Trf具有显著的酸性、还原性响应的磁共振成像能力,可有效提高肿瘤解剖学成像的对比度。本论文利用蛋白质作为纳米反应器构建了多种载无机材料蛋白纳米粒,对其在肿瘤多模态成像与光热治疗方面的应用进行了研究,并为该蛋白纳米体系在肿瘤诊疗领域中的应用奠定了一定的科学基础。
【图文】：

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肿瘤成像与治疗效果，实现肿瘤精确诊断与高效治疗，显示出良好的生物应用前景。逡逑本章节以蛋白质为基础，阐述蛋白纳米粒常用构建方法及其在肿瘤诊断和治疗中的应逡逑用（图１．１），对一些具有代表性的蛋白纳米粒进行介绍，并以此提出立题依据。逡逑，＇舰邋°、。逡逑＾逦＾邋％１邋％．邋１－－逡逑Ｉ逦％逡逑°邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｓｒ逡逑！邋，邋＇Ｊｆ逡逑＾ｎｏｒｅａｃ＾逡逑图１．１：蛋白纳米粒用于肿瘤诊疗一体化的示意图。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１．邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｂａｓｅｄ邋ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ邋ｆｏｒ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ邋ａｎｄ逡逑ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．逡逑ｌ．ｉ蛋白纳米粒的构建逡逑蛋白是一类具有生物功能的大分子，通过氨基酸序列折叠形成不同结构和功能的逡逑结构域、特殊结合位点等，影像探针或治疗用药可通过静电吸附、疏水作用、特殊位逡逑２逡逑

透射电镜,透射电镜,纳米,示意图

己是多种肿瘤的一线治疗药物［５＜）］。Ｌｉｕ等［５１］在此基础上利用紫杉醇强疏水性诱导白蛋逡逑白在水溶液中发生自组装同时包载化疗药物紫杉醇及碳菁类染料吲哚菁绿，构建了多逡逑功能蛋白纳米粒ＨＳＡ－ＩＣＧ－ＰＴＸ邋（图１．３）。在近红外激光照射下有效增加细胞膜通透逡逑性，促使化疗分子紫杉醇进入肿瘤细胞，化疗联合光热治疗不仅能彻底消除皮下肿瘤，逡逑而且能够显著提升转移肿瘤的治疗效果，延长活体生存周期，具备良好的临床转化前逡逑辱＞［５１］逡逑Ａ邋ｒＺ，邋Ａ邋ｍ邋ＰＴＸ逡逑妙，，逦Ｉ邋ＩＣＧ逦ｈ邋v|逡逑ＨＳＡ逦？邋｝、ＨＳＡ－ＩＣＧ－ＰＴＸ邋ＮＰｓ逡逑謇柋■逡逑图邋１．３：邋（Ａ）邋ＨＳＡ－ＩＣＧ－ＰＴＸ邋制备过程示意图；（Ｂ）邋ＨＳＡ、ＨＳＡ－ＩＣＧ邋及ＨＳＡ－ＩＣＧ－ＰＴＸ逡逑透射电镜图［５１］。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３．邋（Ａ）邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ＨＳＡ－ＩＣＧ－ＰＴＸ邋ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．邋（Ｂ）逡逑ＴＥＭ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ＨＳＡ，邋ＨＳＡ－ＩＣＧ，邋ａｎｄ邋ＨＳＡ－ＩＣＧ－ＰＴＸ［５１］．逡逑受益于白蛋白优异的生物相容性和较长的血液循环时间，白蛋白纳米载体可显著逡逑改善药物的药代行为，延长血液半衰期。另外，白蛋白自身的粒径约７．２邋ｎｍ，载药或逡逑者修饰后很容易将其调整到具有较好ＥＰＲ效应的粒径范围内
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730;R318.08

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