【摘要】：癌症是一类严重危害人类健康的重大疾病。肺癌的发病率和死亡率是所有癌症中最高的。虽然我们在肺癌的预防、诊断和治疗等方面已经取得很大的进步,但目前肺癌患者的预后仍然不乐观,5年存活率为仅4-17%,所以急需深入研究其发生发展的机制,制定有效的治疗方案。越来越多的研究显示,肿瘤由多种亚群细胞构成。其中有一部分细胞具有类似于干细胞的自我更新能力和多向分化潜能,称之为肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)。CSC可以进行不对称分裂,不仅可以分裂出保留CSC生物学特性的子代细胞,而且可以分化出实体瘤所包含的其它类型的肿瘤细胞,从而驱动肿瘤的形成并促进肿瘤的发展。CSC同样被认为是转移瘤的起始细胞。随着肿瘤不断生长,不同的亚群细胞生存竞争越来越激烈,生存压力驱动肿瘤细胞进化。具备细胞分化能力的CSC有更大的进化优势,经历上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)等过程的CSC获得更强的迁移侵袭能力,从肿瘤原发部位转移到其它器官组织。自我更新和多向分化潜能使CSC分化出能适应新环境的子代细胞,最终形成转移瘤。化疗抵抗是肺癌治疗面临的一个重大难题。CSC是导致化疗抵抗的重要因素。CSC可以通过增强膜转运蛋白活性和激活抗凋亡通路等方式抵抗化疗。常规化疗药物杀死大多数肿瘤细胞,存活的CSC通过自我更新和分化导致癌症的复发。CSC对肿瘤的发生、转移、化疗抵抗、复发都起重要作用,通过作用于调控CSC的信号通路抑制CSC成为治疗肺癌的新策略。叉头框(fork head box,FOX)蛋白是一类具有一段高度保守翼状环DNA结合域的转录因子。FOXA1、FOXM1、FOXQ1等多个FOX家族成员被证实是调控CSC的重要转录因子。Forkhead box C1(FOXC1)是FOX蛋白家族成员之一,在多种癌症中证实有促癌的作用。最近有研究表明FOXC1与细胞干性密切相关。FOXC1对毛囊干细胞、造血干细胞的干性有重要调控作用。Hedgehog和Notch是调控CSC的重要信号通路。FOXC1不仅可以通过直接调节内皮细胞中的Dll4来激活Notch信号通路,而且可以通过直接结合Gli2来增强Hedgehog信号通路活性,所以FOXC1很可能与CSC密切相关。使用UALCANC分析TCGA数据库,我们发现在非小细胞肺癌(NSCLC)的癌组织中FOXC1的表达水平显著增高,但目前没有文献报道FOXC1在NSCLC中对CSC的调控作用,因此本研究探究FOXC1是否对NSCLC肿瘤干细胞样特性有影响。第一部分FOXC1在NSCLC中表达以及对生存期的影响目的:探究FOXC1在NSCLC中表达以及对生存期的影响。方法:使用UALCANC在线分析TCGA数据库中NSCLC患者的癌组织和肺正常组织中FOXC1的表达差异。使用The Human Protein Atlas在线分析TCGA数据库中NSCLC患者的癌组织中FOXC1表达量和生存期的关系。结果:FOXC1在肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)癌组织中的表达显著高于肺正常组织(P0.01,P0.01)。与低表达FOXC1的LUAD和LUSC的患者相比,高表达FOXC1的LUAD和LUSC患者的存活率更低(P0.05,P0.05)。结论:1.FOXC1在NSCLC癌组织中的表达异常增高,FOXC1可能是影响NSCLC发生的重要因素。2.FOXC1表达与NSCLC患者的存活率呈负相关,FOXC1可能是影响NSCLC患者预后的重要因素。第二部分FOXC1对NSCLC肿瘤干细胞样特性的影响目的:探究FOXC1对NSCLC肿瘤干细胞样特性的影响。方法:1.使用慢病毒构建FOXC1低表达和高表达稳转细胞株。2.实时荧光定量PCR检测基因的m RNA水平。3.Western Blot检测基因的蛋白水平。4.流式细胞术检测CD133+细胞比例。5.干细胞球形成实验检测肿瘤干细胞的自我更新能力。6.裸鼠移植瘤实验检测NSCLC细胞的致瘤能力。7.使用Transwell检测NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。8.采用CCK-8检测细胞活力。9.采用流式细胞术检测凋亡细胞比例。结果:1.FOXC1增强NSCLC肿瘤细胞干性:(1)FOXC1表达降低抑制NSCLC肿瘤细胞干性。1)与对照细胞A549-LV-sh Control相比,FOXC1低表达稳转细胞A549-LV-sh FOXC1的FOXC1 m RNA和蛋白水平显著降低(P0.01,P0.01)。2)FOXC1表达减少显著降低CD133+细胞的比例(P0.01),3)减少干细胞球数目(P0.01),4)降低肿瘤干细胞功能标志物SOX2、Oct4、NANOG、ABCG2的m RNA水平(P0.01,P0.01,P0.01,P0.01)和蛋白水平(P0.01,P0.01,P0.01,P0.01)。(2)FOXC1表达升高增强NSCLC肿瘤细胞干性。1)与对照细胞NCI-H1299-LV-Control相比,FOXC1高表达稳转细胞NCI-H1299-LV-FOXC1的FOXC1 m RNA和蛋白水平显著增高(P0.01,P0.01)。2)FOXC1表达增高显著增加CD133+细胞的比例(P0.05),3)增多干细胞球数目(P0.01),4)增高肿瘤干细胞功能标志物SOX2、Oct4、NANOG、ABCG2的m RNA水平(P0.05,P0.01,P0.05,P0.01)和蛋白水平(P0.01,P0.05,P0.01,P0.01)。2.FOXC1增强NSCLC细胞的致瘤能力:(1)FOXC1表达降低抑制NSCLC细胞的致瘤能力。1)FOXC1低表达稳转细胞A549-LV-sh FOXC1 5×103、5×104、5×105组裸鼠皮下移植瘤实验的成瘤率(1/8、6/8、7/8)低于对照细胞A549-LV-sh Control的成瘤率(4/8、7/8、8/8)。2)A549-LV-sh FOXC1细胞组的肿瘤体积小于对照细胞A549-LV-sh Control的肿瘤体积。3)A549-LV-sh FOXC1细胞5×105组的肿瘤重量明显减轻(P0.01),A549-LV-sh FOXC1细胞5×103和5×104组的肿瘤重量平均值小于A549-LV-sh Control细胞5×103和5×104组的肿瘤重量平均值,但在统计学上无显著性差异(P0.05,P0.05)。(2)FOXC1表达升高增强NSCLC细胞的致瘤能力。1)FOXC1高表达稳转细胞NCI-H1299-LV-FOXC1裸鼠皮下移植瘤实验的成瘤率(3/8、6/8、8/8)高于对照细胞NCI-H1299-LV-Control的成瘤率(1/8,4/8、7/8)。2)NCI-H1299-LV-FOXC1细胞组的肿瘤体积大于NCI-H1299-LV-Control细胞组的肿瘤体积。3)NCI-H1299-LV-FOXC1细胞5×104组的肿瘤重量明显大于NCI-H1299-LV-Control 5×104组肿瘤重量(P0.01),NCI-H1299-LV-FOXC1细胞5×103和5×105组的肿瘤重量平均值大于NCI-H1299-LV-Control细胞5×103和5×105组的肿瘤重量平均值,但在统计学上无显著性差异(P0.05,P0.05)。3.FOXC1增强NSCLC细胞的迁移侵袭能力:(1)FOXC1表达降低抑制NSCLC细胞的迁移侵袭。1)FOXC1表达降低不仅显著抑制A549细胞的迁移(P0.01),2)而且抑制A549细胞的侵袭(P0.01)。3)FOXC1表达降低显著减少了间质标志物Vimentin、fibronectin、N-cadherin的蛋白表达(P0.01,P0.05,P0.01),对上皮标志物E-Cadherin蛋白表达无显著影响(P0.05)。(2)FOXC1表达升高促进NSCLC细胞的迁移侵袭。1)FOXC1表达增高不仅显著促进NCI-H1299细胞迁移(P0.01),2)而且促进NCI-H1299细胞的侵袭(P0.01)。3)FOXC1表达增高显著增加了间质标志物Vimentin、fibronectin、N-cadherin的蛋白表达(P0.05,P0.01,P0.05),NCI-H1299细胞细胞中未检测到上皮标志物E-Cadherin的蛋白表达。4.FOXC1诱导NSCLC细胞产生化疗抵抗:(1)FOXC1表达降低增加NSCLC细胞的化疗敏感性。1)FOXC1表达降低显著增强顺铂和多烯紫杉醇对A549细胞活力的抑制作用,2)增加顺铂和多烯紫杉醇导致的凋亡细胞的比例(P0.01,P0.01),3)增高凋亡蛋白cleaved caspase-3和促凋亡蛋白BIM的蛋白水平(P0.01,P0.05)。(2)FOXC1表达升高降低NSCLC细胞的化疗敏感性。1)FOXC1表达升高显著减弱顺铂和多烯紫杉醇对NCI-H1299细胞活力的抑制作用,2)显著减小顺铂和多烯紫杉醇导致的凋亡细胞的比例(P0.01,P0.05),3)降低cleaved caspase-3和BIM的蛋白水平(P0.01,P0.01)。结论:FOXC1增强NSCLC肿瘤干细胞样特性,包括增强NSCLC细胞干性、致瘤能力和迁移侵袭能力以及诱导化疗抵抗。第三部分FOXC1增强NSCLC肿瘤干细胞样特性的分子机制研究目的:探究FOXC1增强NSCLC肿瘤干细胞样特性的分子机制。方法:(1)荧光定量PCR检测基因的m RNA表达水平。(2)Western Blot检测基因的蛋白表达水平。(3)免疫组化检测基因在瘤组织中的蛋白水平。(4)双荧光素酶报告基因实验检测FOXC1对beta-catenin启动子活性的调控作用。(5)染色质免疫共沉淀(Ch IP)检测FOXC1与beta-catenin启动子的结合位点。(6)使用慢病毒构建beta-catenin低表达和高表达稳转细胞株。(7)流式细胞术检测CD133+细胞比例。(8)干细胞球形成实验检测肿瘤干细胞的自我更新能力。(9)使用Transwell检测NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。(10)采用CCK-8检测细胞活力。结果:1.FOXC1增强beta-catenin启动子活性促进beta-catenin表达:(1)FOXC1表达减少显著降低A549细胞beta-catenin m RNA水平、总蛋白和细胞核蛋白水平(P0.01,P0.01,P0.01)。(2)免疫组化结果显示FOXC1表达的降低减少了beta-catenin在移植瘤中的表达。(3)FOXC1表达增加显著增高NCI-H1299细胞beta-catenin m RNA水平、总蛋白和细胞核蛋白水平(P0.01,P0.05,P0.01)。(4)FOXC1表达的增高显著增加beta-catenin在移植瘤中的表达。(5)双荧光素酶报告基因实验显示FOXC1可以增强beta-catenin启动子活性(P0.01)。(6)在TRANSFAC和JASPARJ数据库分析beta-catenin启动子序列,发现beta-catenin启动子中存在三个FOXC1可能的结合位点:BS1,GTTCGTTTGTT(-1268/-1258)beta-catenin;BS2,TCTATAAACAT(-997/-987)beta-catenin;BS3,TTATTTGTTCA(-821/-811)beta-catenin.。BS1和BS3的突变没有显著影响FOXC1对beta-catenin启动子的激活作用(P0.05,P0.05),BS2的突变显著减弱了FOXC1对beta-catenin启动子的激活作用(P0.01)。(7)Ch IP-PCR结果进一步确认BS2是FOXC1在beta-catenin启动子上的结合位点。2.Beta-catenin介导FOXC1对NSCLC肿瘤干细胞的特性的调控作用:(1)Beta-catenin表达升高逆转FOXC1表达降低对NSCLC肿瘤干细胞样特性的抑制作用。1)与对照细胞相比,A549-sh FOXC1-LV-beta-catenin细胞beta-catenin的总蛋白和核蛋白水平显著升高(P0.01,P0.05)。2)Beta-catenin表达升高逆转FOXC1表达降低对NSCLC细胞干性的抑制作用,使CD133+细胞的比例显著增高(P0.01),干细胞球数目显著增多(P0.01),SOX2、Oct4、NANOG、ABCG2的蛋白水平显著增高(P0.05,P0.05,P0.01,P0.01)。3)Beta-catenin表达升高逆转FOXC1表达降低对NSCLC细胞迁移侵袭的抑制作用。与对照细胞A549-sh FOXC1-LV-Control相比,Beta-catenin表达增高促进A549-sh FOXC1-LV-beta-catenin细胞的迁移和侵袭(P0.01,P0.05)。4)Beta-catenin表达升高逆转FOXC1表达降低引起的化疗增敏作用。与对照细胞A549-sh FOXC1-LV-Control相比,beta-catenin表达增高显著减弱了顺铂和多烯紫杉醇对A549-sh FOXC1-beta-catenin细胞活力的抑制作用。(2)Beta-catenin表达降低逆转FOXC1表达升高对NSCLC肿瘤干细胞样特性的增强作用。1)与对照细胞相比,NCI-H1299-FOXC1-LV-shbeta-catenin细胞beta-catenin的总蛋白和核蛋白水平显著降低(P0.01,P0.05)。2)Beta-catenin表达降低逆转FOXC1表达升高对NSCLC细胞干性的增强作用,使CD133+细胞的比例显著降低(P0.01),干细胞球数目显著减少(P0.01),SOX2、Oct4、NANOG、ABCG2的蛋白水平显著降低(P0.01,P0.01,P0.01,P0.01)。3)Beta-catenin表达降低逆转FOXC1表达增高对NSCLC细胞迁移侵袭的增强作用。与对照细胞NCI-H1299-FOXC1-LV-sh Control相比,beta-catenin表达降低显著抑制NCI-H1299-FOXC1-LV-shbeta-catenin细胞的迁移和侵袭(P0.01,P0.05)。4)Beta-catenin表达降低逆转FOXC1表达增高引起的化疗抵抗。Beta-catenin表达降低增强了顺铂、多烯紫杉醇对NCI-H1299-FOXC1-LV-shbeta-catenin细胞活力的抑制作用。结论:FOXC1通过增强beta-catenin启动子活性促进beta-catenin表达来增强NSCLC肿瘤干细胞样特性。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
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本文编号：
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