HSDL2在人恶性黑色素瘤中的表达及功能研究

发布时间：2020-05-25 16:37

【摘要】：研究背景及目的:恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是由黑色素细胞转化产生的恶性肿瘤。黑色素细胞是由神经嵴分化而来,因此MM发生在由神经嵴细胞分化的组织或器官上,如口腔、鼻腔、胃肠道黏膜、颅脑等部位,但MM发生率最高的器官还是皮肤。恶性黑色素瘤的发病率因人种的不同和生活地区紫外线强度的不同而出现差异性。黑色素是由色素细胞产生,用来保护皮肤免受紫外线的损伤。有数据显示高加索人的MM发病率明显高于非洲人及亚洲人,同种皮肤颜色下生活中紫外线照射强的地区MM的发病率高。对色素痣的刺激及不正确处理也是MM发生的诱因之一。我国人民对恶性黑色素瘤的认识普遍不高,长期户外工作者没有有效的自我防护,减少紫外线对皮肤的损伤,尤其对足底、腰部、口腔黏膜等其他易刺激部位的色素痣没有足够的保护。加之对色素痣的不正确处理如:反复摩擦、化学药物、冷冻、不彻底的切除等均可诱发色素痣的恶变。当患者发现皮肤出现破溃,或肿块时才到医院就诊,此时恶性黑色素瘤往往已出现周围组织浸润,和淋巴结转移,失去了手术治疗的最佳时机。有数据显示0期MM的5年生存率为97%,IV期MM的5年生存率仅为10%。我国的MM发病率虽然不高,约占全身恶性肿瘤的4%~5%,但死亡率却在所有皮肤肿瘤中排名第一,我国MM的5年生存率不足10%。对早期恶性黑色素瘤没有有效的筛查手段,也是MM患者生存率不高的原因之一。因此从基因学角度对恶性黑色素瘤细胞进行研究,寻找有效的生物靶点,是提高早期恶性黑色素瘤的诊断率的重要方法,同时有效的生物靶点,也可为MM的治疗及预后判断提供全新的临床思路。方法:高内涵基因功能筛选平台,筛选在黑色素瘤细胞中的新功能阳性基因HSDL2。构建针对HSDL2基因不同靶点的RNA感染慢病毒载体,在工具细胞293T中,进行Western Blot外源验证靶点有效性,筛选出有效靶点。?使用qPCR方法检测HSDL2基因在不同工具细胞中mRNA均有高丰富度表达。?以HSDL2基因为模板设计RNA干扰靶点及双链DNA oligo制备,并构建慢病毒载体。?在体外感A375(人恶性黑色瘤细胞),使之敲除肿瘤细胞HSDL2基因,筛选后构建HSDL2缺陷的A375稳转细胞珠。(4)qPCR检测HSDL2基因在mRNA水平的基因敲减率。(5)对shHSDL2(A375细胞、加HSDL2基因shRNA病毒感染的细胞组)进行Celigo细胞计数检测细胞生长、MTT检测、PI-FACS细胞周期检测、Annexin V-APC单染法细胞凋亡检测。结果:1.经shRNA慢病毒感染后,qPCR方法检测m RNA水平上实验组A375细胞中HSDL2基因表达量受到明显抑制(p0.05),敲减效率达到90.8%。2.细胞生长检测表明:shHSDL2组(正常A375细胞、加HSDL2基因shRNA病毒感染的细胞组)与shCtrl组(正常A375细胞、加阴性对照病毒感染的细胞)相比,增殖抑制明显。3.MTT检测结果表明:相比shCtrl组,shHSDL2组细胞增殖减缓。4.细胞周期检测表明:shHSDL2组处于S期的细胞增多(P0.05),处于G1期的细胞增多(P0.05),处于G2/M期的细胞减少(P0.05)。5.凋亡检测:相比shCtrl组,shHSDL2组凋亡数增多(P0.05)。结论:干扰目的基因HSDL2可有效降低黑色素瘤细胞A375胞活性、抑制细胞增值、促进细胞凋亡,其可能是MM的有效分子生物靶点,为临床MM的诊断、治疗、预后判断提供新的思路及方法。
【图文】：

序列,基因,靶点,丰度

图 1：HSDL2 基因在 4 种人 MM 细胞株中 mRNA 表达丰度L2 基因 RNA 干扰慢病毒载体制备A 干扰靶点设计SDL2 基因为模板，设计多个 19-21nt RNA 干扰靶点序列。经设

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皖南医学院硕士学位论文表 1 HSDL2 的 shRNA 干扰序基 STEM Loop CCAGAAGCAGTTAGCAAGAAATTCAAGAGATAAACCAGAAGCAGTTAGCAAGAAATCTCTTGAATA体线性化酶切反应效率较高，1 2 3
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.5

【参考文献】