PIWIL2在食管癌发生发展中的作用和机制以及脂肪间充质干细胞分离鉴定的研究

发布时间：2020-05-27 07:13

【摘要】：我国恶性肿瘤发病率持续上升,使我国居民饱受其患,不堪重负。食管癌是最为常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率在世界范围的恶性肿瘤中排第八位,死亡率占第五位。我国是食管癌高发国家,其中90%以上病理类型为鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC),因此食管鳞癌研究对我国居民健康具有重要意义。肿瘤细胞经常发生表观遗传变异,改变肿瘤细胞表达的蛋白质库。近年来研究发现,肿瘤细胞频繁地激活只限于生殖细胞表达的基因。这些基因在正常组织中仅在生殖细胞表达,却被癌细胞频繁激活,来促进增殖转移、抵抗凋亡等,因此这些基因被称为癌/睾丸抗原cancer/testis antigens(CTAs)。PIWIL2蛋白也属于癌/睾丸抗原。PIWIL2是Argonaute蛋白家族的成员,在睾丸组织中特异性表达,用来维持生殖细胞的发育和功能。近年来,研究证明在许多人和鼠的肿瘤组织中都有高表达PIWIL2,并与癌症的发生发展密切相关。但是在食管癌中PIWIL2如何影响癌症进程并没有明确的研究,因此本课题将对PIWIL2在食管癌发生发展中的作用机制进行研究。我们通过检测食管癌样本中PIWIL2的表达情况探究PIWIL2在食管癌中的临床意义,并通过体内实验、体外实验明确PIWIL2对食管癌的影响及其作用机制。在40对食管癌组织中的PIWIL2的mRNA表达量显著高于相对应的癌旁组织。同时,我们采用免疫组织化学技术和Westernblot技术检测NMBzA诱导的大鼠食管癌模型中PIWIL2蛋白的表达量,证实从正常食管到异型增生再到食管癌整个发展过程,PIWIL2表达量逐步增加,说明其对食管癌的发生发展起到重要指示作用。体外细胞实验证实过表达PIWIL2可增强食管癌细胞的增殖、侵袭、耐药、裸鼠成瘤能力,并且增加了肿瘤干细胞比例。同时,在敲降PIWIL2的食管癌细胞系中得到同样的证实。接下来,我们对过表达PIWIL2的KYSE30细胞及对照组细胞进行RNA测序,筛选出差异基因,并对其进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析,富集到PI3K/Akt和TGF-[β信号通路以及干细胞多能性相关通路。Westernblot实验结果显示过表达PIWIL2的KYSE30细胞和KYSE150细胞中,p-Akt表达水平明显升高,证实PIWIL2通过活化p-Akt表达从而激活PI3K/Akt信号通路,促进细胞增殖。并且PIWIL2激活TGF-β/Smad信号通路和促进基质金属蛋白酶MMP14、MMP9的表达从而促进细胞发生上皮间质转化EMT,促进侵袭转移。我们还发现PIWIL2能够上调干性转录因子Sox2、Oct4、Nanog、Bmi-1表达从而影响肿瘤干细胞的自我更新。综上所述,PIWIL2在食管癌发生发展过程中起到促进作用,有可能成为食管癌的预后指标及治疗靶点。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是成体干细胞中的一种,可以从多个组织中获得。其中脂肪来源的间充质干细胞由于可从自体脂肪获取、采集方便、取材损伤小、含量丰富、产量高等优点,可满足组织工程和疾病治疗的需要,因此被广泛应用于临床和科学研究中。目前分离MSC的方法主要是用贴壁法分离MSC,但这样分离的MSC是一个混杂的群体,其中的细胞可能具有不同增殖、分化和造血支持方面的能力。使用特定的表面或者细胞内标记,可以鉴别不同的MSC亚群。但是,目前的MSC亚群分类的研究主要集中于骨髓MSC,因此对于脂肪MSC的亚群研究有待于进一步开展。本研究成功从人脂肪组织中分离出脂肪间充质干细胞,具有成纤维细胞样的形态,并且成旋涡状生长。流式细胞术和免疫荧光法均证实细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105 呈阳性表达,CD31、CD34、CD45 呈阴性表达。用 RT-PCR方法证实干性基因Sox2、Oct4、Nanog的mRNA表达水平,脂肪间充质干细胞明显高于成纤维细胞、食管癌细胞系KYSE150、宫颈癌细胞系Hela。MSC具有成脂肪、成骨、成软骨多向分化能力。我们在研究中发现,CD105的阳性率随着代数的增加而递减,而其他表面标志物指标则无变化,因此我们用CD105分选了 MSC,进一步研究CD105(+)MSC和CD105(-)MSC的差异。形态学观察CD105(-)MSC细胞贴壁能力变差、逐渐悬浮脱落,细胞内容物增多不清晰透明,并且增殖减慢,群体倍增时间延长,并且更快走向衰老死亡,只能增殖到20代左右,而CD105(+)MSC能继续增殖到38代。CD105(+)MSC干性基因Sox2、Oct4、Nanog的mRNA表达水平均高于CD105(-)MSC。CD105(+)MSC和CD105(-)MSC均能向成脂肪和成骨分化。MSC染色体核型分析,均为正常染色体核型,保证了其染色体水平的稳定性。我们通过CD105分选出的MSC亚群实现了更加长期稳定的培养,并且通过染色体核型分析检测了其安全性,为临床应用和科学研究提供了重要的种子细胞。
【图文】：

食管上皮,食管癌,动物模型,大鼠

图１－１、ＮＭＢｚＡ诱导大鼠食管癌动物模型病理结果逡逑（Ａ）正常大鼠食管上皮；（Ｂ）增生阶段大鼠食管上皮；（Ｃ）轻度不典型增生阶段大逡逑鼠食管上皮；（Ｄ）重度不典型增生阶段大鼠食管上皮；（Ｅ）大鼠食管上皮乳头瘤；逡逑

大鼠,阶段,食管上皮,不典型增生

实验结果逡逑在增生阶段有弱阳性表达，在不典型增生阶段ＰＩＷＩＬ２染色强度和阳性细胞百分率逡逑升高，到了食管癌阶段，在整个食管上皮强表达。（图１－２Ａ，Ｂ）同时，我们用逡逑Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ的方法检测到同样的结果（图１－２Ｃ）。逡逑Ａ逦ＰＩＷＩＬ２逡逑Ｎｏｒｍａｌ逦Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ逦Ｄｙｓｐｌａｓｉａ逦Ｃａｒｃｉｎｏｍａ逡逑１５－１逡逑Ｂ逦＊＊逡逑Ｉ逦Ｔ逡逑（Ｏ逡逑ｉ５＇邋ｔ邋Ｉ逡逑。｜邋＋逦￣￣，，—逡逑／邋／邋／邋／逡逑ｃ逦ｉ－：逦＾￣￣—￣￣赢邋＾邋ｎ逡逑ＰＩＷＩＬ２邋＊逡逑ＧＡＰＤＨ逦ｍｍｍ逡逑ｆ邋０逦命逡逑图１－２、ＰＩＷＩＬ２在大鼠食管癌组织中的蛋白表达水平逡逑３７逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1

【参考文献】