参桃软肝方对HBx蛋白导致的肝癌DNA甲基化状态的影响

发布时间：2020-05-28 20:44

【摘要】：目的:参桃软肝方是广州中医药大学第一附属医院院内制剂,是国医大师周岱翰教授多年来的临床经验方,有健脾养肝、软坚消ve之效,大量前期研究证明,参桃软肝方治疗乙肝病毒相关性肝癌患者临床疗效明确。HBx是HBV基因组四个开放阅读框中,与肝癌关系最密切的一个基因。HBx与肝癌的发生密切相关,HBx可通过DNA甲基化途径促进肝癌的发生。本课题观察参桃软肝方治疗乙肝病毒相关性肝癌患者的作用机制,细胞及动物实验观察参桃软肝方的抑瘤功效,探讨参桃软肝方对乙肝病毒相关性肝癌Hbx表达的影响,揭示参桃软肝方治疗肝癌的分子机制,为参桃软肝方临床推广应用提供科学的理论支持。方法:1.临床上,选取病理组织学或细胞学证实的确诊为原发性肝癌;HBsAg阳性6个月以上,HBV-DNA载量5.0×102IU/mL的患者入组,给予参桃软肝片口服,一次6片,一日3次。分别于服药前及服药后抽血检测HBx启动子区域DNA甲基化水平。2.按标准方法制备参桃软肝方(STR)冻干粉,并将其作用于人肝癌HepG2.2.15细胞模型,CCK8检测细胞生长抑制率,计算STR的IC50。取对数生长期的HepG2.2.15细胞分别标记为溶剂对照组、中药加5-Aza-CdR组、5-Aza-CdR组、中药组。通过Western blot检测STR对HepG2.2.15细胞株中HBx、DNMT1蛋白表达量的影响。荧光定量 PCR 检测 HBx mRNA、DNMT1 mRNA、DNMT3A mRNA、DNMT3B mRNA。将对数生长期的HepG2.2.15细胞,加入基础培养基、1mg/mL的STR药液的基础培养基培养72小时后。利用BSP检测HBx启动子区域CpG位点甲基化水平。3.腋窝皮下注射HepG2人肝癌细胞悬液以建立BALB/c-nu小鼠肝癌移植瘤模型。按照小鼠体重、性别随机分为模型组、STRGP低剂量组、STRGP中剂量组、STRGP高剂量组,每组8只。灌胃体积按小鼠体质计算,均为0.1ml/10g,给药频次与给药时程:每天1次,连续给药4周。分别于给药前、给药第5天、第10天、第15.天、第20天、第30天测量瘤体大小,计算各组小鼠肿瘤体积。小鼠给药30天处死后,剥离瘤体,称重并测量瘤体。此外,取16只HBV转基因小鼠按雌雄、体重分层,随机分组为对照组、中药组每组8只。对照组每3日以生理盐水灌胃。灌胃体积按小鼠体重计算,均为0.1ml/10g,中药组参桃软肝片采用临床成人用药剂量的等效剂量的4倍(剂量根据本课题组前期实验设定),配置适量生理盐水,37度加热成混悬液,0.1ml/10g灌胃。给药频次与给药时程:每天1次,连续给药4周。其后采用摘眼球取血法收集小鼠血液,采用全自动临床生化分析仪及生化试剂检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)的含量;采用PCR检测HBV-DNA载量。结果:1.临床研究表明,STRGP可促进乙肝病毒相关性肝癌患者HBx DNA启动子区甲基化。患者分别于服药前后抽血检测,由图可见服用STRGP30天后,HBxDNA启动子区CpG位点甲基化水平由0.7%增加至48.5%,STRGP促进了乙肝病毒相关性肝癌患者HBx DNA启动子区甲基化。2.细胞实验表明,参桃软肝方抑制HepG2.2.15细胞的生长呈时间和剂量依赖性。HepG2.2.15细胞经过不同剂量(0.5mg/ml-2.5mg/ml)浓度梯度的STR处理24h、48h及72h后,与对照组比较,随着STR浓度的升高细胞存活力较对照组降低。且在1.Omg/ml、1.5mg/ml、2.Omg/ml、2.5mg/ml 处,随着 STR 处理时间的延长,HepG2.2.15细胞存活力呈降低的趋势。STR抑制肝癌HepG2.2.15细胞生长,且该抑制呈时间依赖性和剂量依赖性,同一时间点各浓度STR之间有显著性差异(P0.001),同一浓度STR在各时间点有显著性差异(P0.001)。HepG2.2.15细胞72h半数抑制率IC50(Half Maximal Inhibition Concentration)数值为:0.6389 mg/ml。结果表明,STR 可抑制HepG2.2.15细胞的增殖,呈时间和剂量依赖关系。Western blot检测表明HepG2.2.15细胞经过STR处理72h后,HBx蛋白表达量降低,STR组与对照组相比差异有统计学意义(P0.01),STR组与STR+5-Aza-C组相比差异有统计学意义(P0.01),STR组与5-Aza-C组相比差异有统计学意义(P0.01),即当抑制DNMT1的表达时,STR无法使HBx蛋白表达量降低。说明了 STR通过DNA甲基化抑制HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达。进一步用荧光定量PCR技术在转录水平检测STR对HBx、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达的影响。结果显示,HepG2.2.15细胞经过STR处理72h后,HBx mRNA表达量降低,STR组与对照组相比差异有统计学意义(P0.05),STR组与STR+5-Aza-C组相比差异有统计学意义(P0.001),即当抑制DNMT1的表达时,STR无法降低HBx mRNA表达量。这进步一说明可STR通过DNA甲基化抑制HepG2.2.15细胞中HBx mRNA的水平。HepG2.2.15细胞经过STR处理72h后与对照组比较,DNMT1 mRNA、DNMT3A mRNA、DNMT3B mRNA的表达量均有升高,但STR组与Con组DNMT1 mRNA相比较无显著性差异P=0.1244(P0.05);STR 组与 Con 组 DNMT3A mRNA 相比较无显著性差异 P=0.264(P0.05;STR组与Con组DNMT3BmRNA相比较无显著性差异P=0.3449(P0.05)。本研究通过观察STR作用HepG2.2.15后HBx表达变化,发现STR可以在蛋白质及RNA水平抑制HepG2.2.15细胞中HBx的表达。进一步加入5-Aza-C后,发现在蛋白质及RNA水平,STR均无法抑制HBx的表达,说明在HepG2.2.15细胞中,STR通过DNA甲基化来抑制HBx的表达。BSP实验表明参桃软肝方可促进HepG2.2.15细胞HBx的甲基化,可以看到STR 1mg/mL作用72小时后HBx启动子区由原来的非甲基化变为低甲基化,HBx DNA启动子区CpG位点甲基化水平由0%增加至68.1%。3.动物实验,STRGP作用于BALB/c-nu小鼠肝癌移植瘤模型后,接种HepG2细胞一周后,裸鼠腋下皮肤肉眼可见移植瘤体,分组给药前保持瘤体在同一基线水平,然后分组给药统计分析得出,在给药前各组瘤体大小无差别,给药后第10天,与模型组相比较,STRGP高剂量组移植瘤体积偏小,两组统计学有显著性差异(P0.05)。给药后第15天、第20天、第30天,与模型组相比较,STRGP高剂量组移植瘤体积显著偏小,两组比较有显著性差异(P0.001)。该统计结果说明STRGP高剂量可抑制裸鼠HepG2移植瘤体积的增长并且该抑制作用会伴随给药时间的增加而增强。给药后第15天、第20天、第30天,与STRGP低剂量组相比较,STRGP高剂量组移植瘤体积显著偏小,两组比较有显著性差异(P0.001)。给药后第15天,与STRGP中剂量组相比较,STRGP高剂量组移植瘤体积显著偏小,两组比较有显著性差异(P0.01)。给药后第20天、第30天,与STRGP中剂量组相比较,STRGP高剂量组移植瘤体积显著偏小,两组比较有显著性差异(P0.001)。STRGP低剂量和高剂量组与模型组比较,瘤体重量都有下降。STRGP有抑制肿瘤重量的作用,F=19.56,P=0.0126(P0.05),两两比较中,STRGP高剂量与模型组比较,瘤体重量有显著性差异(P0.01);STRGP高剂量与STRGP低剂量组比较,瘤体重量有显著性差异(P0.01);STRGP高剂量与STRGP中剂量组比较,瘤体重量有显著性差异(P0.01)。STRGP高剂量组可以抑制移植瘤体积以及瘤体重量的增长。STRGP作用于HBV转基因小鼠,给药前取血清检测16只转基因小鼠HBV-DNA载量,两组小鼠实验前HBV-DNA载量在同一基线水平,二者无统计学差异P=0.4805(P0.05)。比较给药后STRGP组与对照组HBV-DNA载量,发现STRGF组HBV-DNA定量均数较对照组低,但二者无统计学差异P=0.6453(P0.05)。STRGF对HBV转基因小鼠肝功能的影响的统计结果:STRGF较对照组比较,可降低HBV转基因小鼠AST数值,两组比较的差异有统计学差异P=0.001。STRGF较对照组比较,可降低HBV转基因小鼠ALT数值,两组比较的差异有统计学差异P=0.0087,(P0.001)。STRGF组与对照组转基因小鼠相比,STRGF组ALP数值无显著差异,P=0.5347(P0.05)。STRGF组与对照组转基因小鼠相比,STRGF组ALB数值无显著差异,P= 0.3777(P0.05)。STRGF组与对照组转基因小鼠相比,STRGF组PA数值无显著差异,P=0.1558(P0.05)。STRGF组与对照组转基因小鼠相比,STRGF组D-BIL数值无显著差异,P=0.2634(P0.05)。STRGF组与对照组转基因小鼠相比,STRGF组T-BIL数值无显著差异,P=0.6403(P0.05)。结论:1.STR治疗肝癌疗效明确,本实验临床研究表明STR可以促进HBV相关性肝癌患者HBx DNA启动子区域CpG位点的甲基化,而HBx被认为是HBV基因组编码的蛋白中与肝癌关系最密切的蛋白之一,HBx可以通过各种途径导致肝癌的发生发展,启动子区域的高甲基化可抑制HBx蛋白的表达,从而达到抑制肝癌生长的目的。本研究清晰揭示了临床中STR治疗肝癌的分子机制,促进了 STR的临床推广应用。2.STR能抑制稳转HBV基因组的人肝癌细胞株的生长,且抑制作用呈时间和剂量依赖性。3.STR通过DNA甲基化抑制HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达。4.STR通过DNA甲基化抑制HepG2.2.15细胞中HBx mRNA的表达。5.STR能抑制裸鼠HepG2肝癌移植瘤的体积及重量的增长,且抑制作用随着给药时间的延长而增加。6.STR能改善HBV转基因小鼠肝功能的损伤,降低HBV转基因小鼠的AST、ALT指标。
【图文】：

肝硬变,DNA甲基化,肝细胞癌,肝炎

[105]。随着对肝癌的深入了解，大量研究证实了表观遗传学在肝癌的发生发展过程中起着重要的作用。表观遗传学包括了 DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重组、核小体的重塑等，其中在肝癌中，DNA 甲基化研究最为广泛[106-108]。正常组织中表观遗传学的改变可能会促进肿瘤的发生。例如，肝硬化多为肝癌的前导疾病，这可能与引起肝硬变的慢性肝细胞损伤以及炎症反应导致的全基因组 DNA甲基化改变有关。但支持这一理论的研究尚存在争议。Kondo[109]等人研究发现正常肝组织与肝硬变组织二者的 DNA 甲基化水平无差异。然而，有研究者证实了在肝硬化患者以及肝炎患者中，存在甲基化水平增高以及肿瘤抑癌基因功能丧失[110]。p16 的超甲基化会导致了 p16 基因的失活，而 p16 启动子区域甲基化水平增高与肝细胞癌的发生有关[111]。研究者还检测了被增生性结节以及肝硬变结节包裹的肝细胞癌中 p16 甲基化水平，证实了在肝癌早期 p16 超甲基化的现象，清楚的揭示了从肝硬化结节发展到增生性结节的肝癌发生过程。此外，研究者通过对肝癌组织以及正常组织的对比发现 APC,GSTP1, RASSF1A, p16, COX-2 以及 E-cadherin 甲基化水平有变化[112-114]。因此我们可以推测肝硬变导致 DNA 甲基化以及表观遗传学的改变从而引起早期肝癌的发生（如图 1 所示）。

氨基酸序列,增强子,箭头,启动子

图 2. HBV 基因组图谱[125]Figure 2. Hepatitis B virus (HBV) genome map.V 的基因组是双链 DNA (3.2 kb)，，其中包含四个重叠的开放阅读框架(ORFs)分别pre-S1/pre-S2/S)(蓝色箭头)，核心蛋白(pre-C/C)(黄色箭头)，病毒聚合酶(绿箭色箭头)。基因组包含四个启动子，两个增强子区域(Enh1, Enh2)和两个直接重patitis B virus x (HBx)是一种高度保守的含有 154 氨基酸蛋白质，分7 kDa。因为氨基酸序列与任何已知的蛋白质都不同源，故 HBx 即为蛋白[122]。它主要集中在细胞质中，在肝细胞的细胞核中较少[123]。由于 HBV到宿主基因组中，即使在没有完整的 HBV 病毒复制的情况下 HBx 基因也胞中维持存在和转录[124,125]。HBx 蛋白并不直接与 DNA 结合，而是激活各启动子和增强子[123]。HBx 可以调节和激活各种基因的表达，有表观调节乙酰化、miRNAs 和 lncRNAs)，且可导致各种通路及功能的异常(详见
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

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