高表达INK4位点反义非编码RNA在肾细胞癌中的功能和调控机制及维甲酸查尔酮对肾癌细胞抑制性的研究

发布时间：2020-05-29 00:47

【摘要】：背景和目的:INK4基因位点的反义非编码RNA(ANRIL)是一种长链非编码RNA,最初是在患有家族性黑色素瘤的病人身上发现的。在那之后,越来越多的证据已经确定了ANRIL对癌症的发生和发展有影响。ANRIL编码于染色体9p21区域,并已被证明可以调节其相邻的、依赖于细胞的激酶抑制剂(CDKN)2a/2b,通过表观遗传机制来充当肿瘤抑制因子。最近,一项研究表明,CDKN2B突变可能是家族性RCC的一个新原因。因此,我们假设ANRIL可能参与了RCC的发生发展。考虑到目前学界对于ANRIL在RCC进程中的作用知之甚少,因此揭示ANRIL在RCC中的调节作用是非常重要的。维甲酸和其他类维生素a(RAs)被大量用于皮肤病的预防和治疗。在治疗癌症方面,维甲酸已经被证明具有一定的功效。众所周知,维甲酸会对几种癌症的正常细胞和异常细胞的体外增殖、分化和凋亡产生影响(结肠、前列腺、肺癌和白血病)。有报道称,所有的反式维生素酸(ATRA)和9-cis RA都会影响神经母细胞瘤和星形细胞瘤细胞的形态分化、增殖和基因表达。ATRA和13-cis RA业已被用于治疗复发性恶性脑胶质瘤。众所周知,类维生素a具有抗人类恶性神经胶质瘤扩散、转移和侵入性的活性,这表明类维生素a是一种合适的抗癌药物,可以抑制肿瘤的发展。在最新的研究中,也揭示了维甲酸酰胺与其母体化合物在人类肝癌细胞凋亡中的作用。方法:1.在临床肿瘤组织和4种RCC细胞株中,采用RT-PCR评价ANRIL的表达水平;2.转染了ANRIL过表达载体后,对细胞存活、细胞集落数、细胞凋亡、转移和肿瘤侵袭能力进行评价;3.对与细胞凋亡、上皮间质过渡(EMT)和β-catenin信号通路相关的蛋白质的表达进行了评估,同时还评价了IWR-endo(β-catenin信号通路抑制剂)对细胞活力、转移和入侵以及β-catenin信号通路蛋白表达的影响;4.为了研究维甲酸查尔酮(RAC)对细胞增殖和肾癌细胞凋亡的影响,利用MTT法和流式细胞术来检测癌细胞增殖和细胞凋亡,并检查细胞周期;5.利用westernblot和免疫组织化学方法,对肾细胞癌(RCC)和正常肾组织中的Notch1和Jagged1的表达水平进行检测。结果:1.ANRIL在RCC组织和RCC细胞系中得到了高度的表达;2.ANRIL显著促进细胞增殖、转移、入侵和EMT,但抑制细胞凋亡;3.β-catenin、Ki-67、糖原合成酶激酶3(gsk-3)、磷酸化gsk-3、T细胞转录因子4(TCF-4)和白血病增强因子1(LEF-1)的表达水平都明显受到了ANRIL的正调控;4.沉默ANRIL的生物功能与ANRIL过表达的生物功能相反。ARNIL对RCC细胞的增殖、转移和入侵的影响可以通过IWR-endo来逆转;5.在ACHN和769-p细胞中,用30μM RAC处理72 h后,处于G2/M期细胞的比例增加到45.27%和54.23%。同时,处理后的769-p和ACHN肾细胞癌凋亡的比例约为59.27%和69.71%。高于对照组的5.23%和4.93%;6.与正常的肾组织相比,在肾癌组织中,Notch1和Jagged1阳性染色率分别为95.3%和93.0%。正常肾组织则分别为36.4%和42.4%。肾癌组织的治疗在96小时后显著降低了Notch1和Jagged1的染色率。结论:1.在RCC中高度表达的ANRIL,通过激活链状途径,在RCC细胞中充当致癌物质;2.RAC可以诱导RCC在G2/M期停留,同时诱导细胞凋亡,使其成为治疗肾细胞癌的有效药物。
【图文】：

吉林大学博士学位论文32（P<0.05 或 P<0.01）。在图2B 中，相比于对照组，ANRIL 过表达的 786-O 和 A498细胞的相对细胞集落数都显著地增强了（P<0.05 或 P<0.01）。而 ANRIL 沉默这两种细胞的相对细胞集落数相比于对照组都显著地减少了（P<0.05 或P<0.01）。ANRIL对细胞凋亡的影响与对细胞的生存能力影响完全相反。如图2C所示，与对照组相比，ANRIL 过表达显著地降低了（P<0.05）786-O 的凋亡率，，而 ANRIL的沉默对 786-O 细胞凋亡率有显著的增加（P<0.05）。在图 2D 中显示了凋亡相关蛋白的表达水平。ANRIL 的过度表达显著的下调了凋亡前体 Bax 的表达量，而 ANRIL 的沉默则显著的上调了 Bax 的表达量。抗凋亡蛋白 Bcl-2 的结果与 Bax刚好相反。ANRIL 的过度表达显著的上调了 Bcl-2 的表达量，而 ANRIL 的沉默则显著的下调了 Bcl-2 的表达量。从以上结果我们不难看出，ANRIL 可以有效的促进 RCC 细胞的增殖

第 4 章 ANRIL 影响肾癌细胞的作用机制路关键转录因子的 mRNA 和蛋白质表达。在图 4 C 和图 4D 比值中，T 细胞因子-4（TCF-4）和淋巴增强因子-1（LEF-1）的 mRNA 和蛋白质表达水平都明显受到了 ANRIL 过表达的明显正调节（P<0.001）。而与 si-NC 组相比，ANRIL 沉默组这两种蛋白的 mRNA 和蛋白质表达水平均显著降低（P<0.05）。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.11

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本文编号：2686102