【摘要】：第一部分ZNF139在胃癌组织及转移淋巴结中的表达研究目的:胃癌是最常见的恶性消化道肿瘤,其死亡率高居该类肿瘤首位。早期胃癌患者无明显症状,因此多数胃癌患者确诊时已发展至中晚期。胃癌细胞对化疗药物敏感性较差,因此其化疗效果差,导致五年生存率低。胃癌的发生和发展受多种因素的调控,其中包括肿瘤侵袭、转移、粘附、细胞外基质降解和肿瘤血管形成等诸多病理改变的复杂过程。锌指蛋白具有特定的生物结构,能够同DNA结合,作为转录因子调节多种生物功能。研究报道锌指蛋白调控相关基因转录和表达,参与肿瘤发生和发病过程。目前关于ZNF139在胃癌发生和发展中作用机制尚不明了。本研究通过检测胃癌组织中ZNF139表达水平,分析ZNF139在胃癌组织、转移淋巴结中的表达,探索ZNF139表达水平同胃癌进展和转移的关系,为探索胃癌治疗新靶点奠定基础。方法:本研究收集了胃癌组织、癌旁组织和正常胃粘膜(均为21例);收集胃癌患者淋巴结组织21例,所有病例标本均取自2011年2月—2011年9月在河北医科大学第四医院行胃癌手术切除的病例。通过real-time PCR和免疫组织化学染色的方法,分别检测胃癌组织、癌旁组织、正常胃粘膜及淋巴结组织中ZNF139表达水平;利用统计学方法分析ZNF139表达水平与胃癌患者临床病理参数的相关性,所有数据应用SPSS13.0软件分析,P0.05具有统计学意义。结果:1同癌旁组织相比,胃癌组织中ZNF139表达明显升高(1.416±0.032vs 2.021±0.054,P0.05),提示ZNF139基因可能参与了胃癌发生过程;2同无癌转移淋巴结组织相比,癌转移淋巴结中ZNF139表达水平明显升高(1.00±0.144 vs 2.227±0.249,P0.05),提示ZNF139基因可能参与了胃癌的转移过程,ZNF139高表达更易于发生淋巴结转移;3通过对胃癌中ZNF139基因表达情况与患者临床病理特征的分析,ZNF139与胃癌分化程度、浸润深度、临床TNM分期及淋巴结转移密切相关,即分化程度越低,浸润深度越深,临床分期越晚及伴淋巴结转移者,ZNF139 mRNA和蛋白表达越高,进一步说明ZNF139基因同胃癌的发展演进及恶性程度密切相关。结论:1在胃癌组织和胃癌转移淋巴结中ZNF139表达升高;2 ZNF139同胃癌的分化、浸润、临床TNM分期及淋巴转移相关。第二部分ZNF139影响胃癌细胞对5-FU敏感性的研究目的:化疗是中晚期胃癌治疗的重要手段。胃癌细胞对化疗药物的敏感性低影响其化疗的效果。这是胃癌病人致死的重要原因之一。因此,解决胃癌耐药性将显著提高其化疗效果,改善胃癌的预后。本研究检测了多种不同分化程度的胃癌细胞中ZNF139表达水平;分析ZNF139同胃癌细胞5-FU耐药性的关系;探讨ZNF139调节胃癌细胞5-FU耐药性的分子机制。这些研究也为胃癌治疗提供新的思路。方法:1利用MTT法检测不同胃癌组织对氟尿嘧啶(5-FU)敏感性;2利用real-time PCR检测不同胃癌组织ZNF139和多药耐药性相关基因MDR1/P-gp,MRP1,BAX和Bcl-2表达水平;3转染siRNA抑制SGC7901细胞中ZNF139表达水平,探讨ZNF139对胃癌细胞5-FU敏感性的影响。结果:1 5-FU敏感性高的胃癌组织中ZNF139表达水平低;2 5-FU敏感性高的胃癌组织中MDR1/P-gp,MRP1,和Bcl-2表达水平低,BAX表达水平高;3在SGC7901细胞中转染ZNF139-siRNA 48小时后,ZNF139表达水平低,胃癌细胞5-FU敏感性升高;4在SGC7901细胞中转染ZNF139-siRNA 48小时后,ZNF139表达水平低,MDR1/P-gp,MRP1,和Bcl-2表达水平低,BAX表达水平高。结论:1 5-FU敏感性高的胃癌组织中ZNF139表达水平低;2胃癌组织中5-FU敏感性同MDR1/P-gp,MRP1,BAX和Bcl-2相关;3胃癌细胞中抑制ZNF139表达改善5-FU敏感性。第三部分沉默ZNF139抑制人胃癌细胞增殖的研究目的:胃癌是世界发病率第四的恶性肿瘤。胃癌的发生受到多种基因共同调节,但是起关键作用的因子尚不明了。本研究旨在探讨siRNA-ZNF139对胃癌细胞增殖的影响及分子机制,将为开展胃癌的基因治疗提供理论基础。方法:1分别以siRNA-scramble和siRNA-ZNF139表达载体转染SGC7901细胞48小时后,在荧光显微镜下观察绿色荧光表达水平评价转染效率;2利用real-time PCR和Western blot检测转染SGC7901细胞中ZNF139 mRNA和蛋白表达水平;分别以siRNA-scramble和siRNAZNF139表达载体转染SGC7901细胞48小时后,利用EdU染色和MTT法检测细胞增殖水平;3分别以siRNA-scramble和siRNA-ZNF139表达载体转染SGC7901细胞48小时后,利用real-time PCR方法和Western blot方法检测转染SGC7901细胞Bcl-2和survivin基因mRNA和蛋白表达水平;4建立人胃癌裸鼠原位移植瘤模型,验证ZNF139对胃癌细胞增殖的影响。结果:1在SGC7901细胞中siRNA-scramble和siRNA-ZNF139表达载体转染效率达到85%;2同siRNA-scramble相比,转染siRNA-ZNF139能够显著降低ZNF139 mRNA和蛋白水;3在SGC7901细胞中沉默ZNF139能够抑制细胞生长;在SGC7901细胞中沉默ZNF139能够降低Bcl-2和survivin基因mRNA和蛋白表达水平;4在人胃癌裸鼠原位移植瘤模型中沉默siRNA-ZNF139能够显著降低BCL2和survivin蛋白水平。结论:1在SGC7901细胞中沉默ZNF139能够降低Bcl-2和survivin蛋白表达,抑制细胞增殖;2在人胃癌裸鼠原位移植瘤模型中沉默ZNF139降低Bcl-2和survivin蛋白表达。第四部分miR-195-5p通过调节ZNF139影响胃癌细胞多药耐药性的研究目的:胃癌一种常见的消化系统癌症。中晚期胃癌细胞对化疗药物敏感性低影响其化疗效果,导致胃癌致死率高。因此,研究胃癌细胞多药耐药性的分子机制具有重要的科学意义。在第二部分中,我们证明了ZNF139能够调节胃癌细胞耐药性,但是ZNF139上游调控机制尚不清楚。microRNA是一簇长度为21到22核苷酸的非编码小RNA分子,它们具有重要的生物学功能,参与癌症的发生和发展。microRNA以碱基互补原则结合在下游靶基因mRNA的3'-非编码区,影响其转录或者翻译效率。在本研究中检测了不同分化程度的胃癌细胞中miR-195-5p表达水平;分析miR-195-5p同胃癌细胞多药耐药性的关系;探讨miR-195-5p通过调节ZNF-139影响胃癌细胞多药耐药性的分子机制。该研究为治疗胃癌提供了新的治疗靶标。方法:1利用MTT法检测低分化和高分化胃癌细胞对5-FU和L-OHP敏感性;2利用real-time PCR检测不同分化程度胃癌组织中miR-195-5p和多药耐药性相关基因p-gp,mrp1和bcl-2 mRNA水平;3在MNK28细胞中转染miR-195-5p mimic或miR-195-5p inhibitor高表达或低表达miR-195-5p,检测ZNF139和多药耐药性相关基因MDR1/P-gp,MRP1和Bcl-2蛋白表达水平;分析miR-195-5p对5-FU和L-OHP敏感性的影响;4生物信息学软件预测ZNF139是miR-195-5p下游靶基因;利用荧光素酶活性实验和Western Blot证明miR-195-5p能够直接结合在ZNF139mRNA 3'-UTR并抑制其蛋白表达;5在MNK28细胞中共同转染miR-195-5p inhibitor和ZNF-139 siRNA,检测ZNF139和多药耐药性相关基因MDR1/P-gp,MRP1和Bcl-2蛋白表达水平;验证miR-195-5p通过ZNF139影响胃癌细胞多药耐药性。结果:1低分化胃癌细胞对5-FU和L-OHP敏感性高;2同高分化胃癌细胞相比,低分化胃癌细胞中miR-195-5p表达水平升高;多药耐药性相关基因p-gp,mrp1和bcl-2 mRNA水平降低;3高表达miR-195-5p抑制多药耐药性相关基因P-gp,MRP1和Bcl-2蛋白表达,促进胃癌细胞对5-FU和L-OHP敏感性;低表达miR-195-5p促进多药耐药性相关基因P-gp,MRP1和Bcl-2蛋白表达,抑制胃癌细胞对5-FU和L-OHP敏感性;4 ZNF139是miR-195-5p下游靶基因;miR-195-5p能够直接结合在ZNF139 3'-UTR上抑制其蛋白表达;5沉默ZNF139能够逆转miR-195-5p inhibitor对胃癌细胞多药耐药性的作用。结论:1 miR-195-5p同胃癌细胞多药耐药性相关;2 miR-195-5p通过调节ZNF139影响胃癌细胞多药耐药性。
【图文】：
图 1 在胃癌组织中 ZNF139 mRNA 水平升高he mRNA level of ZNF139 was increased in the gastric canceNA levels of ZNF139 were significantly increased in gastr (normal group: normal gastric tissues; adjacent group: adjacetissues; GC group: gastric cancer tissues; n=21; *P<0.05 vs
图 2 正常组织、癌旁组织和胃癌组织中 ZNF139 免疫组化染色（SP×400）Fig.2 The immunohistochemical staining of ZNF139 in normal tissues,adjacent tissues and gastric cancer tissues (SP×400)The number of ZNF139-staining-positive cells was significantly increased ingastric cancer tissues. (normal group: normal gastric tissues; adjacent group:adjacent gastric cancer tissues; GC group: gastric cancer tissues).
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
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