MiR-24靶向调控FBXW7对舌鳞状细胞癌细胞增殖侵袭的影响及机制研究

发布时间：2020-06-01 18:46

【摘要】：目的:舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是口腔肿瘤中最常见的恶性肿瘤。舌癌的主要治疗方法是手术治疗辅以放化疗的综合治疗。虽然近十年来治疗技术在不断改进,但总体临床治疗效果提高并不显著。通过探求舌癌发生发展的机制从而寻求有效的治疗方法是改善舌癌病人预后的关键,也是舌癌防治的热点,具有深远的临床和科学意义。FBXW7基因是SCF类泛素连接酶E3复合物中特异性识别底物的关键因子,在细胞的分裂、生长及分化过程中起重要调控作用。FBXW7主要通过泛素介导的蛋白水解系统进而靶向降解Cyclin E、Notch1、Jun和Myc等癌蛋白,调控细胞的分裂、生长及分化过程,被认为是一种抑癌基因。FBXW7基因突变已经在多种人类肿瘤中被发现,深入研究FBXW7基因在生理、病理过程中的作用,对于了解FBXW7相关的肿瘤发生机制和制定靶向FBXW7途径的癌症治疗策略至关重要。MiRNA是一类内源性的单链小型非编码RNA,成熟的miRNA可在转录后水平通过促进靶基因mRNA的降解和/或抑制其翻译过程而发挥负调控基因表达的功能。MiRNA在许多肿瘤中存在异常表达,在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用。相关研究发现,miR-24在多种恶性肿瘤中表达异常,在肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移等过程中起重要调控作用,呈现为抑癌基因或癌基因的功能。研究发现,miR-24在舌癌肿瘤组织较癌旁组织中高表达,但是miR-24在舌癌发生、发展中的作用及具体机制尚不清楚。因此,本研究探讨舌癌组织中FBXW7的表达水平及其与预后关系,进一步分析miR-24是否可靶向调控FBXW7,进而影响舌癌细胞的生物学行为。方法:1.收集天津医科大学肿瘤医院舌鳞状细胞癌患者95例,利用免疫组化法检测舌癌石蜡组织中FBXW7蛋白的表达情况,分析FBXW7表达水平与舌鳞状细胞癌患者临床病理资料以及预后之间的关系。2.应用Real-time PCR方法检测27例TSCC患者癌组织与癌旁组织中miR-24的表达情况,分析miR-24的表达水平与舌鳞状细胞癌患者临床病理资料之间的关系。应用RT-PCR方法检测27例TSCC患者癌组织与癌旁组织中FBXW7的表达水平。应用Pearson法,分析癌组织中miR-24及FBXW7的表达水平的相关性。3.验证miR-24对FBXW7基因的靶向调控。利用TargetScan生物信息学技术预测miR-24的可能靶基因。利用RT-PCR和Western blotting法检测FBXW7mRNA和蛋白水平的变化。应用荧光素酶报告实验分析验证FBXW7是miR-24的靶基因。4.分析miR-24通过调控FBXW7对舌鳞状细胞癌细胞增殖及侵袭的影响。在舌鳞状细胞癌细胞中转染miR-24或anti-miR-24后,CCK-8法检测细胞增殖的变化,Transwell实验检测细胞侵袭的变化。在舌鳞状细胞癌细胞中转染Si-FBXW7或FBXW7表达质粒,检测细胞增殖和侵袭的变化。共转染miR-24和FBXW7,检测细胞增殖和侵袭的变化。结果:1.免疫组织化学结果显示,FBXW7蛋白在癌旁组织中的表达水平显著高于癌组织(?~2=6.023,P=0.014)。FBXW7蛋白的表达水平与肿瘤分化程度、临床分期显著相关(P0.05)。预后分析显示,FBXW7蛋白高表达组患者的中位生存时间显著长于低表达组(80.00±11.88月vs 38.00±5.63月,?~2=19.785,P=0.000),FBXW7蛋白的表达水平是舌癌患者预后的独立影响因素。2.Real-time PCR检测显示癌组织中miR-24的表达水平显著高于癌旁组织(Z=-4.541,P0.01)。miR-24的表达水平与肿瘤的分化程度及临床分期显著相关(P0.05)。癌组织中FBXW7 mRNA的表达水平显著低于癌旁组织(Z=-3.556,P0.01)。相关分析结果显示舌癌组织中miR-24的表达水平与FBXW7表达水平呈显著负相关(r~2=0.384,P=0.001)。3.通过生物信息学技术,筛选并确认了miR-24可靶向FBXW73~’UTR。转染miR-24可抑制FBXW7 mRNA和蛋白水平。荧光素酶报告基因实验结果显示FBXW7是miR-24的靶基因。4.转染miR-24后舌癌细胞的增殖和侵袭能力明显增强。转染FBXW7后舌癌细胞的增殖和侵袭能力明显减弱。共转染实验结果显示miR-24可通过负向调控FBXW7促进舌鳞状细胞癌的增殖及侵袭。结论:1.FBXW7蛋白在舌鳞状细胞癌中呈低表达,与肿瘤分化程度、临床分期显著相关。FBXW7蛋白的表达水平是舌癌患者预后的独立影响因素。2.miR-24在舌鳞状细胞癌中呈高表达,其表达水平与肿瘤的分化程度及临床分期显著相关。相关分析结果显示舌癌组织中miR-24的表达水平与FBXW7表达水平显著负相关。3.FBXW7是miR-24的靶基因,miR-24可通过负向调控FBXW7促进舌鳞状细胞癌的增殖和侵袭。
【图文】：

蛋白,舌癌,细胞浆,细胞核

天津医科大学博士学位论文一、舌癌组织中 FBXW7 蛋白的表达情况及与患者预后的研究1.2.2 FBXW7 蛋白在舌癌组织及癌旁组织中的表达情况应用免疫组织化学方法检测 FBXW7 蛋白的表达情况，结果显示 FBXW7 蛋白主要定位在于细胞核，也有少许定位于细胞浆，阳性结果表现为细胞核、细胞浆染色为棕黄色或褐黄色。FBXW7 蛋白在癌旁组织呈高表达（图 1-1），在舌低分化鳞状细胞癌组织中低表达（图 1-2），在舌高分化鳞状细胞癌组织中高表达（图 1-3）。FBXW7 蛋白在癌旁组织的表达水平显著高于癌组织（ 2=6.023，，P=0.014）（表 1-2）。A B

蛋白,褐黄色,癌组织,表达水平

胞浆染色为棕黄色或褐黄色。FBXW7 蛋白在癌旁组织呈高表达（图 1-1），在舌低分化鳞状细胞癌组织中低表达（图 1-2），在舌高分化鳞状细胞癌组织中高表达（图 1-3）。FBXW7 蛋白在癌旁组织的表达水平显著高于癌组织（ 2=6.023，P=0.014）（表 1-2）。图1-1 FBXW7蛋白在癌旁组织中的表达情况。FBXW7蛋白在癌旁组织高表达，（A×100，B×200）。A BA B
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.86

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