结直肠癌相关piRNAs的筛选及其对结直肠癌干细胞样特性的调控及机制研究

发布时间：2020-06-02 05:41

【摘要】：第一部分结直肠癌相关pi RNAs的筛选背景和目的:结直肠癌在世界范围内的发病率和病死率非常高,严重威胁着人类健康。Piwi蛋白相互作用RNAs(Piwi-interacting RNAs,piRNAs)是一类新颖的非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs),在多种肿瘤中异常表达。但结直肠癌中piRNA表达谱的变化尚无报道。本部分研究旨在了解结直肠癌中piRNA表达谱的改变,并筛选出结直肠癌相关piRNAs。方法:应用深度测序技术探讨结直肠癌和癌旁组织中piRNA表达谱的差异,并筛选结直肠癌相关piRNAs。应用real-time PCR技术对筛选出的结直肠癌相关piRNAs进行验证,并观察这些piRNAs表达与患者临床病理特征的关系。结果:深度测序结果显示,结直肠癌和癌旁组织中piRNAs的种类分别占小ncRNAs的0.17‰和0.23‰,其表达分别占0.11‰和0.08‰。尽管结直肠癌和癌旁组织中pi RNAs的表达非常低,但却存在明显差异,其总体表达在结直肠癌中上调。我们总共筛选出33个在结直肠癌中上调的piRNAs,2个下调的piRNAs。其中,piR-18849、piR-19521和piR-17724是3个上调最明显的piRNAs。Real-time PCR进一步证实了piR-18849、piR-19521和piR-17724在80例结直肠癌组织中的表达高于其配对的癌旁组织。此外,piR-18849的表达与肿瘤的分化程度和淋巴结转移相关,piR-19521的表达仅与肿瘤的分化程度相关。而piR-17724的表达与患者的临床病理特征之间没有相关性。结论:pi RNAs的总体表达在结直肠癌中上调,其可能参与了结直肠癌的发生。piR-18849和piR-19521有望成为结直肠癌患者预后的指标。第二部分结直肠癌相关pi R-19521增加结直肠癌干细胞样特性背景和目的:复发和转移是导致结直肠癌患者高病死率的主要原因。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是启动肿瘤发生、维持肿瘤生长、导致肿瘤复发和转移的根源,根除CSCs将有望降低结直肠癌患者的病死率。piRNAs参与生殖干细胞干性的维持,而CSCs与生殖干细胞具有相似的特性,提示piRNAs可能也参与调控CSCs的功能。然而pi RNAs是否参与结直肠癌干细胞(colorectal cancer stem cell,CRCSC)样特性的调控,目前尚不清楚。本部分研究旨在明确第一部分筛选出的结直肠癌相关piRNA piR-19521是否调控CRCSC样特性。方法:首先应用real-time PCR技术在结直肠癌组织中观察piR-19521表达与CRCSC标志物表达之间的关系。然后应用无血清培养法从3种结直肠癌细胞系中富集CRCSCs,观察piR-19521在CRCSCs和相应肿瘤细胞中的表达差异。最后在结直肠癌细胞系中过表达piR-19521,在CRCSCs中抑制piR-19521,从体内、体外水平观察piR-19521对CRCSC样特性的影响。结果:我们发现在结直肠癌组织中piR-19521的表达与CRCSC标志物CD29、CD133、CD166和Lgr5的表达呈正相关。piR-19521在CRCSCs中的表达显著高于结直肠癌细胞。过表达piR-19521促进CRCSC标志物与胚胎干细胞标志物SOX2的表达,增加CRCSC亚群的比例。过表达piR-19521促进结直肠癌细胞克隆形成、迁移和侵袭,同时也促进细胞的体内成瘤及肝转移。然而,抑制pi R-19521抑制CRCSC标志物和SOX2的表达,降低CRCSC亚群的比例。此外,抑制piR-19521降低CRCSCs的肿瘤起始和自我更新能力,抑制CRCSCs的体内成瘤及肝转移。结论:结直肠癌相关piR-19521在CRCSCs中表达上调,并促进CRCSC样特性的获得,从而促进肿瘤细胞侵袭及转移,其有望成为结直肠癌治疗的新靶点。第三部分piR-19521通过促进ALX4表达增加结直肠癌干细胞样特性背景和目的:上一部分研究结果表明piR-19521调控CRCSC样特性,但参与这一过程的分子机制目前尚不清楚。本部分研究旨在阐明piR-19521调控CRCSC样特性的机制。方法:应用数字基因表达谱(digital gene expression profiling,DGE)技术,筛选piR-19521调控CRCSC样特性的靶基因,并在细胞水平对靶基因的表达和功能进行验证。应用生物信息学和分子生物学技术阐明piR-19521调控该靶基因表达的分子机制。结果:DGE测序结果显示,过表达piR-19521导致899个基因表达上调,662个基因表达下调。GO功能分析和Reactome通路分析表明这些差异表达的基因参与细胞的多种生物过程,包括与肿瘤发生和转移相关的细胞增殖、细胞凋亡、血管形成以及细胞连接等生物过程。我们筛选出了piR-19521的靶基因ALX4,并进一步证实过表达piR-19521促进ALX4的表达,抑制piR-19521抑制ALX4的表达。CRCSCs中ALX4的表达显著高于结直肠癌细胞。在HCT116细胞中过表达ALX4促进CRCSC标志物和SOX2的表达,增加CRCSC亚群的比例。补救实验结果表明,过表达ALX4可抵抗piR-19521抑制导致的干细胞标志物表达的下降和自我更新能力的降低。在结直肠癌细胞中piR-19521来源于活性增强子元件。piR-19521通过调控其基因座附近区域H3K27ac标记的富集提高增强子的活性。结论:piR-19521通过上调ALX4表达增加CRCSC样特性。首次表明piR-19521可调控增强子的活性,具有增强子RNAs的功能。
【图文】：

图 1 结直肠癌和癌旁样本中小 ncRNAs 的总体差异.1 The overall difference of small ncRNAs in colorectal cancer sampand adjacent samplesenn chart shows the species of small ncRNAs in colorectal cmples (T) and adjacent samples (N).enn chart shows the reads counts of small ncRNAs in colorectal cmples (T) and adjacent samples (N).

图 2 结直肠癌和癌旁样本中各类小 ncRNAs 的种数和表达Fig.2 Species number and reads counts of various types of small ncRNAs incolorectal cancer samples and adjacent samplesA. Pie charts show the species of various types of small ncRNAs in colorectalcancer samples and adjacent samples.B. Pie charts show the reads counts of various types of small ncRNAs incolorectal cancer samples and adjacent samples.
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

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本文编号：2692693