中性粒细胞胞外诱捕网的病理作用及硫化氢的干预

发布时间：2020-06-02 12:58

【摘要】：背景和目的中性粒细胞被激活后,其核DNA与胞浆颗粒蛋白一起形成纤维网状结构,即中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil Extracellular Traps,NETs),此过程称为“NETosis”。传统观点认为,NETs可以捕获病原微生物,在固有免疫反应中具有重要意义。然而,最新研究显示,在糖尿病过程中,NETosis会持续存在,释放的NETs阻碍伤口愈合。此外,流行病学资料显示,多种肿瘤在糖尿病时发病率也明显升高,那么NETs是否参与糖尿病时肿瘤的发生呢?目前尚未见报道。另外,本实验室长期以来一直从事硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)的相关研究,其通过减少活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的生成可发挥明显的抗氧化效应,而ROS在NETosis发生过程中起着重要作用。那么H2S能否通过减少ROS生成抑制NETosis发生进而促进伤口愈合呢?基于此,本文的研究目的是:1.明确糖尿病足部溃疡患者体内NETs水平;2.建立NETosis体外模型,收集NETs并用其处理肿瘤细胞,观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响;3.观察H2S对糖尿病伤口愈合障碍的影响,探讨其机制是否与抑制NETosis有关。方法1.分别收集糖尿病足溃疡患者和健康志愿者外周血5例,分离血清,检测ds NDA和中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)的活性,观察糖尿病足溃疡患者血清中NETs成分的含量。2.分离健康志愿者外周血中性粒细胞,瑞氏-吉姆萨染色后在显微镜下初步观察分离细胞的形态,进一步用APC CD11b抗体标记分离的细胞,流式细胞分析术分析中性粒细胞的纯度。3.佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)刺激中性粒细胞,建立NETosis体外模型。Western blot法检测NETosis相关蛋白精氨酸脱亚胺酶4(Peptidylarginine Deiminase 4,PAD-4)和瓜氨酸化组蛋白3(Citrulline Histone 3,Cit-H3)的表达情况,明确PMA诱导NETosis形成的最适浓度和最佳时间。4.用25 n M PMA刺激中性粒细胞2 h,差速离心法提取培养皿底部NETs,通过Western blot法检测髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、基质金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9,MMP-9)以及NE,并用Pico Green检测ds DNA含量,从而对提取物进行鉴定。5.将提取的NETs与几种常见肿瘤细胞(肝癌细胞SMMC7721、肺癌细胞A549、宫颈癌细胞Hela)共培养48 h后。采用CCK-8法检测细胞活力,观察NETs对肿瘤细胞增殖能力的影响;NETs与肿瘤细胞共培养后用胰酶消化,接种于96孔板,分别检测总细胞和6 h后贴壁细胞数目,计算细胞粘附率;将不同浓度的NETs置于Transwell板下室,与上室的肿瘤细胞共培养48 h,0.5%结晶紫染色后用显微镜观察NETs对肿瘤细胞迁移能力的影响。6.在小鼠背部制作直径为6 mm的全层皮肤伤口,测量计算小鼠伤口面积,Western blot法检测伤口组织NETosis和NETs相关蛋白的表达,探讨NETosis对糖尿病小鼠伤口愈合的影响。腹腔注射H2S(以Na2S为供体),通过检测皮肤伤口面积以及伤口组织ds DNA含量和NE活性,探讨H2S促进糖尿病小鼠伤口愈合是否与抑制NETosis有关。7.分离中性粒细胞,25μM H2S预处理1 h后再给予25 n M PMA刺激2 h,通过核酸染色从形态上初步观察H2S对PMA诱导的NETs释放的影响,进一步检测培养皿底部NETs成分(ds DNA含量、NE和MPO活性)的变化。通过二氢罗丹明123检测ROS的含量。最后,通过检测NETosis相关蛋白PAD-4和Cit-H3的表达,明确H2S对抗PMA诱导的NETs释放是否与抑制NETosis有关。结果1.糖尿病足溃疡患者血清ds DNA含量明显高于健康志愿者(P0.01),其NE活性也高于健康志愿者(P0.05)。2.对分离细胞用瑞士-吉姆萨染色后在显微镜下观察显示,细胞主要为分叶核;流式细胞术定量分析显示,APC CD11b阳性率为99.95%。结果提示分离得到的细胞以中性粒细胞为主,并且中性粒细胞含量大于95%。3.不同浓度PMA处理中性粒细胞后,PMA浓度为25 n M时PAD-4和Cit-H3表达达到峰值。在2 h内,随着处理时间延长,PAD-4和Cit-H3的表达时间依赖性升高。通过Western blot法检测提取物显示,提取物中含有ds DNA、MPO、MMP-9和NE,而且MPO和NE具有催化活性。4.用不同浓度的NETs处理糖尿病过程中常见的三种癌细胞,检测细胞活力显示,低浓度(0.13μg/ml)NETs处理48 h可诱导肝癌细胞SMMC7721增殖,而对另外两种细胞无明显影响。进一步检测NETs对SMMC7721细胞粘附和迁移能力的影响,结果显示,NETs可明显增强SMMC7721细胞的粘附和迁移功能(P0.05);当NETs浓度过高时,对各种肿瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用,也能明显抑制肝癌细胞SMMC7721的粘附能力和迁移能力(P0.05)。5.通过观察伤口的愈合状况发现,糖尿病小鼠伤口愈合率明显低于对照组(P0.01);另外,糖尿病小鼠伤口组织NETosis相关蛋白PAD-4和Cit-H3表达明显高于对照组,NETs成分MPO和NE也高于对照组。重要的是,给予H2S治疗后,糖尿病小鼠皮肤伤口愈合率明显高于模型组(P0.01);并且皮肤伤口组织ds DNA含量减少(P0.05),并且NE活性降低(P0.05)。6.在PMA诱导的NETosis体外模型发现,PMA可促进纤维网状ds DNA释放,上调NE和MPO活性(P0.05),以及ROS释放(P0.05),促进NETosis相关蛋白PAD-4和Cit-H3的表达(P0.05)。重要的是,H2S预处理1 h,PMA诱导网状结构消失,NE和MPO活性降低(P0.05),ROS含量减少,并且NETosis相关蛋白PAD-4和Cit-H3的表达也减少(P0.05)。结论本研究证实,糖尿病可致中性粒细胞释放NETs,这些NETs可促进肝癌细胞增殖、粘附和迁移,阻碍糖尿病伤口愈合。H2S处理可抑制NETosis的发生和NETs释放,从而改善糖尿病伤口愈合。本研究为以NETs为靶点的糖尿病皮肤并发症和肝癌发生提供了新的治疗思路。
【图文】：

正常人,DNA含量,血浆,患者

实验结果1. 糖尿病足溃疡患者血清 NETs 高于正常人NETs 是以 DNA 为骨架，镶嵌有胞浆蛋白如 NE 等构成的网状结构。收集临床糖尿病足溃疡患者外周血，分离血清，利用 PicoGreen 与 dsDNA 结合发出荧光，检测 520/480 nm 荧光值，表示血清 dsDNA 含量。结果如图 1（A）所示，与对照组相比，糖尿病足溃疡患者血清 dsDNA 含量升高，差异有统计学意义，P<0.01。进一步检测 NE 活性，如图 1（B）所示，糖尿病足溃疡患者血清 NE 活性比对照组更强，差异有统计学意义，P<0.05。结果表明糖尿病足溃疡患者外周血清 NETs 含量高于正常人。

中性粒细胞,健康志愿者,外周血,分离纯化

图 2 中性粒细胞的分离纯化及鉴定收集健康志愿者外周血，用梯度离心法提取中性粒细胞，图 A 瑞氏-吉姆萨染色法观察分离细胞的形态（放大倍数 100×），图 B 用荧光 APC 标记的单克隆抗体 CD11b 标记中性粒细胞，流式细胞分析术定量分析分离中性粒细胞的数量及百分比。3. 在体外用 PMA 诱导中性粒细胞发生 NETosis3.1 不同浓度的 PMA 对中性粒细胞释放 NETs 的影响分离的中性粒细胞，用显微镜观察明场，对照组中性粒细胞呈圆形，边缘光滑；PMA 刺激后中性粒细胞边缘不规则化，细胞整体变得扁平；使用 Hoechst33258 死细胞核酸进行荧光染色分析，对照组被染上蓝色荧光细胞少，加入 PMA 后被染色蓝色荧光细胞增多，细胞核膨大，细胞间形成网状结构，如图 3。结果提示 PMA能诱导中性粒细胞释放 NETs，，而且随着 PMA 浓度增大中性粒细胞形成的网状结构
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R735.7

【参考文献】