碗烯的自由基生成能力和细胞内分布研究

发布时间：2020-06-02 22:22

【摘要】：光动力治疗是目前用于治疗各种恶性疾病的极具前景的方法之一,具有非侵入性、低毒性等特点。光敏剂作为光动力治疗的基本要素之一,开发高效的新型光敏剂成为当前研究的热点。碳材料能产生活性氧(ROS),例如众多科研工作者发现富勒烯具有显著的光敏特性。因此,碳材料有望应用于光动力治疗,从而拓展其在生物医学领域的应用。与富勒烯具有部分相似结构的碗烯(Cor),是一种性能独特的曲面多环芳烃,具有碗状的空间结构,这种三维拓扑结构赋予碗烯偶极和特殊的电子分布等理化性质。碗烯在紫外光照射下可以诱导产生I型活性氧,即过氧化氢,羟基自由基和超氧阴离子。碗烯的内侧碗底带负电,外侧边缘带正电,即核和外围之间的电子密度不同,从而具有一定的偶极矩(2.2 D)。这种电荷分布不均匀导致的电子离域效应可以促使电子转移的发生,从而在光照下诱导产生ROS。碗烯的水溶性极差,这大大限制了碗烯在生物领域的应用,因此需要适宜的载体来增加水溶性。本课题组设计了两种方式修饰碗烯以增强其水溶性:合成聚乙二醇(mPEG)共价修饰的碗烯衍生物(mPEG-Cor),碗烯的强疏水特性和分子间π-π堆积作用促进其在水中组装成高载药量的纳米胶束体系;选用环糊精(CD)对碗烯进行包合,制备了可溶于水的γ-环糊精/碗烯包合物(γ-CD/Cor)。由于大部分ROS的半衰期很短,扩散距离有限,推测不同载体修饰的碗烯可能导致碗烯诱导产生ROS的差异。作为光敏剂的碗烯,因为曲面结构,电荷分布不均,内侧带负电外侧带正电,具有一定的偶极矩,因此推测碗烯可以靶向具有很高负膜电位(150-180 mV)的线粒体。因此,本课题通过比较不同载体修饰后的两种水溶性碗烯在体外诱导产生的ROS,研究碗烯经过不同载体修饰后诱导产生ROS能力的差异,证明了在体外γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor碗烯衍生物诱导产生ROS的能力更强,说明了不同的修饰方式影响了碗烯诱导产生ROS的能力;利用红色荧光染料来标记碗烯,研究了碗烯靶向线粒体的能力及其细胞内的分布,证明了碗烯的偶极和电子离域效应有利于促进碗烯在线粒体的积聚,提高了光动力学效果。根据本实验室已有的方法,制备了不同载体修饰后的两种水溶性碗烯,即γ-CD/Cor包合物和mPEG-Cor胶束,并比较两者的理化性质。在紫外可见光谱中,mPEG-Cor的两个紫外最大吸收峰与γ-CD/Cor的相比,都发生了大致相同的红移,这是因为具有大π键的碗烯连接上带有炔键的PEG后,共轭作用增强,促使紫外光谱整体红移;利用高效液相色谱法的方法测定了碗烯在两种载体中的载药量,mPEG-Cor胶束中碗烯的载药量为19.1%(w/w),远高于碗烯在γ-CD/Cor包合物的载药量8.8%(w/w);使用马尔文粒度仪和透射电子显微镜对二者的粒径和形貌进行考察,在水中mPEG-Cor自组装形成了纳米尺寸的球状胶束,γ-CD/Cor包合物以单体形式和聚集状态存在,虽然包合物的平均粒径大于胶束的平均粒径,但二者的粒径仍在纳米粒子的范围之内;不同浓度的磷酸盐缓冲液中二者的粒径变化反映其稳定性,两种水溶性碗烯粒径都随着磷酸盐缓冲液浓度的增大而增大,均显示对磷酸盐缓冲液离子强度的依赖性聚集。首先在溶液中比较了不同载体修饰后的两种水溶性碗烯诱导产生ROS的差异。利用活性氧荧光探针DCFH-DA来检测体外ROS产量,随着碗烯浓度的增加和光照时间的延长,两种水溶性碗烯诱导产生的ROS均不断增加。在相同的碗烯浓度和照射条件下,与mPEG-Cor胶束相比,γ-CD/Cor包合物明显产生更多的ROS。这可能由于疏水性碗烯位于胶束的内核中,光照时诱导产生的ROS因为寿命很短,并且扩散距离有限,表观的ROS产量受胶束屏障的限制,而在包合物中无这种限制屏障,因此表现为γ-CD/Cor产生ROS的能力更强,说明Cor产生ROS的能力受修饰的载体影响。为了分析两种水溶性碗烯诱导产生的活性氧种类是否有差异,采用了荧光分析和电子自旋共振光谱法进行检测。利用超氧阴离子荧光探针DHE检测到了二者光照后产生的超氧阴离子,并且γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor胶束诱导产生的超氧阴离子更多;通过使用标准的过氧化氢检测试剂盒,验证了光照后二者均产生了H_2O_2,但产量差异不明显;由于没有检测羟基自由基的稳定并且敏感的商业探针,因此将5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)作为羟基自由基的捕获剂,采用电子自旋共振仪记录反应后的捕获剂(DMPO-OH)的特征波谱,证明了二者在光照下产生羟基自由基的能力,并且γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor胶束诱导产生的羟基自由基更多。因此,无论载体种类如何,修饰后的碗烯在光照下都能诱导产生超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基,但是γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor胶束诱导产生的ROS总量更多。选用人的前列腺癌细胞(PC-3),在细胞水平上探究了不同载体修饰后的两种水溶性碗烯诱导产生ROS能力的差异。首先测定两种水溶性碗烯在细胞摄取量的差异,将碗烯当量相同的γ-CD/Cor包合物和mPEG-Cor胶束与细胞共孵育3小时,采用高效液相色谱法,检测二者在细胞内的摄取程度,计算得包合物和胶束的细胞摄取率分别为4.8±0.8%(w/w)和5.5±0.5%(w/w),胶束比包合物进入细胞内的碗烯略多,但两者之间没有显著性差异,因此该因素不会显著影响细胞水平上的光动力学疗效。两种水溶性碗烯与细胞共孵育3小时后,利用细胞渗透性活性氧荧光探针DCFH-DA检测经光照后碗烯在细胞内诱导产生的ROS含量,并通过激光扫描共聚焦显微镜记录探针的荧光。结果显示,在碗烯当量相同情况下处理的细胞,无光照时没有明显地产生ROS;在相同的光照处理后,细胞内ROS均显著增多,但γ-CD/Cor处理的细胞比mPEG-Cor处理的细胞内ROS的产量更多。两种水溶性碗烯在细胞内产生超氧阴离子的能力,采用超氧阴离子荧光探针DHE检测,检测结果与上述结果相同,γ-CD/Cor产生超氧阴离子的能力更强。不经碗烯处理的对照组细胞,光照前和光照后都无明显的ROS产生。根据文献已知碗烯光照后能够引起线粒体内ROS含量的上升,证明了碗烯在线粒体中的积累。本课题采用检测线粒体内ROS的荧光探针MitoSOX Red,检测两种水溶性碗烯在线粒体内产生的ROS,结果表明与mPEG-Cor相比,γ-CD/Cor在线粒体中产生的ROS更多。产生这种现象的原因可能由于PEG的屏蔽作用,只有mPEG-Cor的游离形式才能被线粒体内化,相比之下,γ-CD/Cor包合物没有这种限制,因此线粒体对碗烯的吸收程度与载体类型有关,γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor胶束能更有效地被线粒体摄取。通过标准的细胞毒性试验检测PC-3细胞存活率,探究了不同载体修饰后的两种水溶性碗烯光动力治疗的疗效差异。将不同浓度的两种水溶性碗烯与细胞共孵育3小时,再进行不同时间的光照,24小时后检测细胞存活率。两种水溶性碗烯在没有光的情况下都不会诱导显著的细胞毒性,即暗毒性低。在5分钟、10分钟、15分钟的光照下,γ-CD/Cor包合物的最大半数抑制浓度(IC_(50))分别为35.2±5.0μM,14.8±2.3μM和9.2±4.7μM。相比之下,mPEG-Cor胶束在的光照10分钟和15分钟时的IC_(50)分别为52.9±8.6μM和22.5±2.6μM。这表明在碗烯浓度相等、光照条件相同条件下,γ-CD/Cor包合物可以诱导更高程度的细胞毒性,疗效更令人满意。作为对照,为了测试光照是否影响细胞对碗烯的敏感性,在相同条件下,首先对细胞进行5分钟、10分钟、15分钟的光照再加入两种碗烯,24小时后检测细胞毒性,结果表明相同浓度的碗烯并不会因为光照时间的不同诱导产生显著不同的细胞毒性,因此光照不会影响细胞对碗烯的敏感性。这两种水溶性碗烯的光毒性都是由碗烯在光照下诱导产生的ROS导致的,虽然环糊精包合和聚乙二醇化都可以增加碗烯的水溶性,但是在细胞水平上γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor胶束能有效地产生ROS,这种差异是一方面是由于两种水溶性碗烯在细胞内诱导产生的活性氧总量不同,另一方面是因为γ-CD/Cor能够将更多的碗烯输送到线粒体,在线粒体中产生更多的ROS,这两方面相结合,γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor胶束产生更理想的光动力抗癌作用。为了检测碗烯靶向线粒体的能力,将在紫外区有弱荧光的碗烯连上一个红色荧光染料,采用深红色的线粒体荧光探针定位线粒体,在激光扫描共聚焦显微镜下观察两者的共定位情况,并且通过计算皮尔逊相关系数(Rr)来实现共定位的定量分析。将带荧光的碗烯与细胞共孵育2小时、4小时、6小时,发现随着孵育时间的增长,碗烯与线粒体的共定位变弱,并且碗烯在除了线粒体之外的其他细胞器中也有分布。这可能是碗烯在与细胞孵育的过程中源源不断地进入细胞导致的。因此将碗烯和细胞孵育2小时后清洗除去细胞外的碗烯,给予碗烯在细胞中自由分布的时间(1小时、2小时、4小时),结果显示随着分布时间的增长,碗烯和线粒体的共定位程度逐渐增强,但是碗烯在细胞内其他细胞器中仍有分布。为了验证碗烯的偶极矩是否增强了碗烯在线粒体中的积累,将与碗烯结构非常相似的平面分子傒连接同样的荧光染料作为对照,同样条件下和线粒体进行共定位实验,实验结果证明,与平面分子傒相比,碗烯与线粒体的共定位程度明显更高,说明了碗烯的偶极矩确实有利于促进碗烯在线粒体中的积累,但是碗烯靶向线粒体的能力比较弱。为了探究碗烯在细胞中的分布,将带荧光的碗烯与溶酶体、内质网、高尔基体主要的细胞器进行共定位实验,发现在这些主要的细胞器中碗烯都有分布,而且碗烯与内质网的共定位程度远大于其他细胞器,但机制需要进一步探究。本课题通过比较不同载体修饰后的两种水溶性碗烯(γ-环糊精/碗烯包合物和聚乙二醇共价修饰的碗烯衍生物)产生ROS的差异,证明了在体外条件下环糊精包合的碗烯比聚乙二醇共价修饰的碗烯诱导产生ROS的能力更强,说明了不同的修饰方式影响碗烯诱导产生ROS的能力,突出了载体在实现碗烯可控释放活性氧的重要性,为光敏剂载体的选择提供思路;本课题也探究了碗烯对细胞器的靶向性及细胞内的分布,碗烯进入细胞后在线粒体、溶酶体、内质网、高尔基体主要细胞器中都有分布,由于曲面碗烯的偶极和电子离域作用,促使碗烯在负膜电位高的线粒体中更易积累,增强了碗烯的光动力学效果。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O613.71;R73-36

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