姜黄素对人结肠癌细胞伊立替康耐药性的影响及其机制研究

发布时间：2020-06-03 21:15

【摘要】：对伊立替康(Irinotecan,CPT-11)、氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)等传统的结直肠癌化疗药物产生耐药性是中晚期结直肠癌患者治疗失败的主要原因之一。其中,仅有30-35%的患者对伊立替康的治疗方案有效,且5年存活率低于10%。越来越多的研究数据证实肿瘤干细胞参与肿瘤耐药性的产生。姜黄素作为一种植物多酚,具有降低结肠癌细胞对化疗药物的耐药性的作用,然而其缓解结直肠癌细胞耐药性的作用是否与肿瘤干细胞相关目前仍尚未完全阐明。第一部分:对伊立替康耐药的人结肠癌细胞株的构建、鉴定及姜黄素对其耐药性、肿瘤干细胞特性的影响目的研究人结肠癌细胞伊立替康耐药性的产生与肿瘤干细胞特性之间的关系,以及姜黄素对人结肠癌细胞伊立替康耐药性的影响,并探讨其机制。方法采用药物持续接触浓度递增法建立对伊立替康耐药的人结肠癌细胞株LoVo/CPT-11细胞;细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测其生长抑制率并计算耐药指数;RT-PCR和Western blot法检测耐药细胞的多药耐药蛋白ABCB1和肿瘤干细胞(CSC)标志物CD44、CD133、EpCAM、CD24在mRNA和蛋白质水平的表达变化。不同浓度的姜黄素(2.5、5μmol/L)分别联合伊立替康作用于耐药细胞,检测姜黄素对其耐药性的影响;RT-PCR和Western blot法检测姜黄素和伊立替康对耐药细胞的肿瘤干细胞标志物表达的影响。结果1.LoVo/CPT-11细胞株能在伊立替康浓度为50μmol/L培养基中稳定生长,LoVo 细胞的半数抑制浓度(IC50)为 43.27±1.64μmol/L,LoVo/CPT-11 细胞的 IC50为 268.72±2.43μmol/L,耐药指数 RI=6.21。2.耐药细胞的多药耐药基因ABCB1和肿瘤干细胞标志物CD44、CD133、EpCAM和CD24在mRNA 水平和蛋白质水平上的表达都显著升高,差异具有统计学意义。3.不同浓度的姜黄素(2.5、5μmol/L)分别联合伊立替康作用于LoVo/CPT-11细胞,均可显著降低LoVo/CPT-11细胞对伊立替康的耐药性,差异具有统计学意义。4.不同浓度的姜黄素处理后的耐药细胞的肿瘤干细胞标志物在mRNA和蛋白质水平的表达均显著下降,并且随着姜黄素浓度的升高,肿瘤干细胞标志物的表达逐渐下调,而伊立替康各浓度组的肿瘤干细胞标志物表达量与对照组相比无显著差异。结论人结肠癌细胞伊立替康耐药性的产生与结肠癌肿瘤干细胞特性相关,姜黄素可能通过抑制肿瘤干细胞特性来降低伊立替康耐药性。第二部分:姜黄素对富集的结肠癌肿瘤干细胞的作用及机制研究目的探究姜黄素对结肠癌肿瘤干细胞生物学特性的影响及其机制。方法采用无血清培养悬浮细胞球的方法富集结肠癌肿瘤干细胞,通过流式细胞术比较LoVo细胞、LoVo/CPT-11细胞和悬浮细胞球中的CD133+细胞比例大小;不同浓度的姜黄素(0,2.5,5,10,20μmol/L)和伊立替康(0,10,20,40,100μmol/L)作用于悬浮细胞,光镜下观察悬浮细胞成球能力的变化并计数各处理组的悬浮细胞球数;Western blot检测姜黄素对悬浮细胞的肿瘤干细胞标志物表达的影响;通过动物荷瘤实验检测姜黄素对悬浮细胞成瘤能力的影响;流式细胞技术检测姜黄素对悬浮细胞凋亡的影响,并采用Western blot法检测不同处理下的悬浮细胞中凋亡相关蛋白的表达变化。结果1.LoVo/CPT-11细胞在无血清培养基中培养1周能够形成典型的悬浮细胞球,悬浮成球细胞中的CD133+细胞的比例为63.3%,较LoVo细胞和LoVo/CPT-11细胞的1.0%和5.0%显著增加。2.随着姜黄素浓度的升高,悬浮细胞成球的数目明显降低,并且当姜黄素浓度达1Oμmol/L以上时无悬浮细胞球生成,而伊立替康对悬浮细胞成球能力无显著影响。另外,姜黄素和伊立替康联合给药时对悬浮细胞成球的抑制作用比姜黄素单药处理时更显著。3.与对照组相比,姜黄素单药组和混合给药组中的悬浮细胞的肿瘤干细胞标志物在蛋白质和mRNA水平表达显著降低,而伊立替康单药组的表达差异无统计学意义。4.未经姜黄素处理组的肿瘤体积显著大于经姜黄素处理组的肿瘤体积,表明姜黄素对结肠癌肿瘤干细胞成瘤能力呈显著抑制作用。5.与对照组相比,姜黄素单药组和混合给药组中细胞凋亡比例增高,抗凋亡相关蛋白表达显著降低,促凋亡相关蛋白表达上升。而伊立替康单药组中细胞凋亡比例变化差异无统计学意义。结论姜黄素对结肠癌干细胞的生物学特性呈抑制作用,这可能与其促进肿瘤干细胞发生凋亡相关。
【图文】：

多药耐药蛋白,标志物,蛋白质水平,细胞

学意义（Ｐ邋＜邋０．０５）。另外与亲本细胞相比，耐药细胞的肿瘤干细胞标志物在逡逑ｍＲＮＡ和蛋白质水平的表达同样也都显著升高，差异具有统计学意义（尸＜逡逑０．０５）。如

姜黄素,细胞增殖,细胞

逑其对耐药细胞的增殖抑制率分别为２．６７±０．０３％和４．３５±０．２４％，两者低于５％，，此逡逑浓度姜黄素可视为无毒性作用。如图２－２所示。逡逑４０－逡逑芑邋■逡逑Ｏ逦Ｔ邋Ｊ邋？逡逑５邋３０－逦＿逡逑ｓ逦N逡逑ｌ２0－逡逑５１°：Ｚ逡逑０邋＾邋＾逦ｉ逦１逦Ｉ逦■逦Ｉ逦■逦ｉ逦＊逡逑０逦１０逦２０逦３０逦４０逡逑Ｃｕｒ邋（｜ｉｍｏｌ／Ｌ）逡逑图２－２姜黄素对ＬｏＶｏ／ＣＴＰ－ｌｌ细胞增殖的影响逡逑不同浓度的姜黄素作用于ＬｏＶｏ／ＣＴＰ－１１细胞２４ｈ。ＣＣＫ－８法测得细胞生长抑制率。每个条逡逑带代表三次独立实验的平均值±标准差。＊Ｐ＜０．０５，邋＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊叩＜０．００１。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｃｕｒｃｕｍｉｎ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｒａｔｅｓ邋ｏｆ邋ＬｏＶｏ／ＣＴＰ－ｌｌ邋ｃｅｌｌｓ．逡逑ＬｏＶｏ／ＣＴＰ－ｌｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｃｕｒｃｕｍｉｎ邋ｆｏｒ邋２４邋ｈ．邋Ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ逡逑ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ邋ｒａｔｅｓ邋ｗｅｒｅ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ＣＣＫ－８邋ａｓｓａｙ．邋Ｅａｃｈ邋ｂａｒ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎ邋士邋ＳＤ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｈｒｅｅ逡逑ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．邋＊Ｐ＜０．０５，邋＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．００１．逡逑２．４姜黄素对耐药细胞耐药性的影响逡逑考虑到高浓度的姜黄素对细胞增殖有一定的抑制作用，对检测姜黄素在细逡逑胞耐药性方面的影响产生干扰
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.35

【参考文献】