长链非编码RNA-XIST与胃癌相关成纤维细胞活化的相关性研究

发布时间：2020-06-11 00:38

【摘要】：研究目的探讨长链非编码RNA XIST(lncRNA-XIST)在胃癌组织及血浆中表达水平与临床意义。原代培养人胃粘膜成纤维细胞(Human gastric mucosa fibroblast,HGMF),并在缺氧条件下刺激其活化。在此基础上验证长链非编码RNA-XIST基因(Long non-coding RNA,lncRNA-XIST)是否与胃癌相关成纤维细胞(Gastric cancer-associated fibroblast,GCAF)活化相关。并寻找可能与RNA-XIST促GCAF活化相关的差异表达基因与信号通路(Pathway)。研究方法收集40例胃癌患者手术切除的胃癌组织及癌旁组织标本,抽取90例胃癌患者术前血浆样本和90例健康体检者血浆样本。利用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)检测上述标本中lncRNA-XIST的表达水平。进行统计学分析并判断lncRNA-XIST表达水平与胃癌患者临床病理参数(年龄、性别、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度、Ki-67阳性率)的关系。通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线,评价血浆lncRNA-XIST在诊断胃癌时的效能。收集胃癌患者术中切除的正常胃粘膜组织,用组织块培养法对胃粘膜成纤维细胞进行原代培养。成功培养后,光学显微镜下鉴定其形态特征,同时用免疫荧光染色鉴定确认细胞来源及纯度;将HGMF与胃癌细胞(SGC-7901和MGC-803)共培养,通过间隙性缺氧处理构建GCAF的体外活化模型。建模成功后,用ELISA法检测细胞培养液中α-SMA、FAP的表达情况,利用CCK-8试验、Transwell迁移试验及流式细胞技术分别检测细胞增殖、迁移及抗凋亡能力,验证是否建模成功;利用qPCR检测GCAF活化前后的lncRNA-XIST基因表达变化情况,验证lncRNA-XIST与GCAF的活化是否存在相关性。利用siRNA干扰GCAF中的lncRNA-XIST基因表达,用ELISA法检测相关活化因子表达水平。利用CCK-8法、Transwell侵袭试验及流式细胞技术分别检测siRNA转染后GCAF的增殖、侵袭及抗凋亡能力,证实lncRNA-XIST与GCAF活化明确相关;用转录组测序技术(RNA Sequencing,RNA-seq)检测和分析出siRNA转染GCAF后的差异基因和相关通路,探寻LncRNA-XIST参与GCAF活化的具体机制。研究结果胃癌组织中lncRNA-XIST表达较癌旁组织升高,胃癌组血浆lncRNA-XIST表达高于健康体检组;差异均有统计学意义(P均0.05)。胃癌组织及血浆中的lncRNA-XIST表达水平与胃癌TNM分期、淋巴结转移、分化程度相关(P均0.05)。培养出的细胞贴壁生长,大小一致,呈长条形或梭状,排列方向大体一致,符合成纤维细胞形态特点。免疫荧光鉴定结果显示细胞结蛋白(Desmin)表达阴性,而波形丝蛋白(Vimentin)表达阳性,符合HGMF的蛋白特征,证明原代培养成功。建立GCAF活化模型后,细胞培养液中CXCL12、IL-6、TGF-β1及HGF表达水平均明显高于对照组(HGMF),差异均有统计学意义(P0.05)。GCAF中α-SMA、FAP相关mRNA较对照组表达明显上调(P0.05);GCAF活化后的细胞增殖、迁徙、抗凋亡能力较HGMF明显增强(P0.05);GCAF的lncRNA-XIST表达量较HGMF显著上调(P0.05)。慢病毒转染后,培养液中前述活化效应分子表达水平均低于空白组和阴性对照组(P0.05),且细胞的增殖、迁移及抗凋亡能力下降(P0.05);干扰lncRNA-XIST表达后,H19、PTP4A1、EIF3E、KLF5、ALB、CYP24A1等基因差异表达,主要参与组织细胞组成和生物合成的调节、有丝分裂细胞周期等生物过程;参与的细胞组织有囊泡、细胞骨架、膜组织等,参与粘附斑激酶信号通路、FcγR介导巨噬细胞吞噬作用等信号通路。研究结论lncRNA-XIST在胃癌组织及血浆中表达升高,并可以促进GCAF的活化过程;下调LncRNA-XIST表达可以抑制GCAF的增殖与迁移能力,并促进其凋亡,提示LncRNA-XIST有可能成为胃癌新的肿瘤标志物和治疗靶点。
【图文】：

表达水平,血浆,和血,肿瘤

所有数据均应用 SPSS 21.0 软件进行分析。所有资料均用 Shapira-Wilkinson 法检其正态性。若计量资料符合正态分布，用（x s）表示，两组比较用 t 检验，多组较用方差分析；若不符合正态分布，则用 M（Q1，Q3）表示，组间比较采用非参检验。通过绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线判断浆中 lncRNA-XIST 表达水平在胃癌诊断中的灵敏度和特异度。所有统计检验均为侧检验，P<0.05 表示差别有统计学意义。三、实验结果1、胃癌组织及血浆中lncRNA-XIST的表达水平根据qRT-PCR数据计算出的2-△ Ct值表lncRNA-XIST与内参基因表达水平的相对倍数关系，2-△ Ct值越大表示lncRNA-XIST表达水平高。结果显示，胃癌组织lncRNA-XIST的2-△ Ct值为0.150(0.094,0.247)，高于癌旁组织[0.0850.041,0.193）]，，差异有统计学意义（P=0.012，图1.1A）。胃癌患者术前静脉血浆lncRNA-XIST2-△ Ct值为0.189（0.119,0.256），与健康体检者[0.144(0.095,0.180)]相比差异具有统计学意义（P0.01，图1.1B）。

ROC曲线,ROC曲线,肿瘤标志物,胃癌

长链非编码 RNA-XIST 与胃癌相关成纤维细胞活化的相关性研究测时，均高于 CEA、CA199、CA724 单独及联合检测时的检测效力（图 1.2，表 1.3）。浆 lncRNA-XIST 诊断 TNMⅠ~Ⅱ期胃癌时 AUC 为 0.694(95%CI 0.592～0.796，P0.01)，灵敏度为 38.5%，特异度为 95.6%，也均优于 CEA、CA199、CA724 单独及合检测（图 1.3、表 1.3）。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

【参考文献】