中央型气道非小细胞肺癌中医证候与病理特征的相关性研究

发布时间：2020-06-11 01:08

【摘要】：1研究背景肺癌严重危害人类生命健康,目前为我国恶性肿瘤死因的第一位,且其发病率仍在不断提高。原发性中央型气道非小细胞肺癌是指原发于气管、主支气管和右中间段支气管的非小细胞性恶性上皮性肿瘤,与其他部位肺癌相比,该类肿瘤在病理组织学特征、临床特点、中医证候分布等方面尚不明确,从而给本疾病的中医、西医治疗治疗造成困难。前期的预实验结果发现,中央型气道非小细胞肺癌中,涎腺型癌占很高的比例,这不仅给西医的病理诊断造成极大困难,同时也为涎腺型癌的中医证候研究带来了新课题。因此,有必要对本组肿瘤进行系统的病理学分析、组织学鉴别诊断、中医证候分析、化疗及预后指标研究等,以期全面地了解其西医分类和中医证候的特点及内在联系,为更有针对性地进行中西医治疗提供理论基础。本课题获得北京中医药大学中青年教师课题资助。2研究目的通过对一组中央型气道非小细胞肺癌进行经典病理学、中医辨证分型、免疫组织化学及分子病理学研究,达到以下目的：①阐明中央型气道非小细胞肺癌的临床病理特点,为西医治疗方案的选择提供指导；②系统研究和探讨中央型气道非小细胞肺癌中医证候的分布情况,确立其与病理组织学、临床特征、肿瘤TNM分期等的相关性,为今后更好地指导中央型气道非小细胞肺癌的中西医结合治疗提供参考依据；③找到一个简单、高效及最优化的抗体组合,用以鉴别中央气道型肺癌的不同组织学类型,包括鳞癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、肌上皮癌、涎腺腺癌(非特指)等；④探讨ERCC1、Beta-tubulin这两种与化疗药物选择、估计预后相关指标在中央型气道非小细胞肺癌中的表达,以及与不同中医证候的关系；⑤通过研究中央型气道非小细胞肺癌不同组织学类型中ALK基因异常情况,探讨克唑替尼等靶向药物用于本组病人治疗的可能性。3研究对象研究对象为病理学诊断证实的肺原发性非小细胞肺癌,临床分期为Ⅲ期及Ⅳ期的患者,病变部位为中央型气道；病例来源为2013年6月至2014年5月间北京煤炭总医院肿瘤微创治疗中心收治的支气管镜介入性治疗的肺癌患者,治疗时收集其切除的肿瘤标本,并收集其临床资料；共收集符合入组标准的109例病人的标本,其中男性91例,女性18例,年龄最小29岁,最大者86岁,中位年龄62岁。4研究内容及方法4.1研究内容①中央型气道非小细胞肺癌的病理组织学类型及临床特点；②中央气道型非小细胞肺癌的中医证候分布特征,以及与病理组织学、TNM分期等的关系；③优化免疫组化抗体组合,以鉴别不同组织学类型的中央型气道非小细胞肺癌；④ERCC1、Beta-tubulin在中央型气道非小细胞肺癌中的表达规律,以及与中医证候的关系;⑤ALK基因的异常改变情况。4.2研究方法4.2.1中医证候判定及临床数据采集中医证候标准根据2002版《中药新药临床研究指导原则》。TNM分期根据2009年AJCC第7版非小细胞肺癌分期标准。通过查阅文献,设计详细的CRF表,从病人的病历记录中提取基础数据资料,对所有的病人进行床旁深度访谈问诊及体格检查,以确定病人的中医证候；所有入组的病人均有病理组织学诊断证实,凡不符合要求者随后剔除,不纳入本研究。4.2.2组织处理及病理学诊断肺癌的组织学诊断标准根据2004WHO肺癌肿瘤分类以及2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌分类标准。标本经中性缓冲福尔马林固定8-72小时,自动脱水机脱水,常规石蜡包埋;制备厚度4微米连续切片,用于HE染色及免疫组化染色；使用全自动组织芯片仪制作组织芯片,用于免疫组化染色。所有切片均由2名高级职称病理医师分别双盲组织学观察、免疫组化观察及评分。对于诊断有分歧的病例则在多头镜下,共同协商确定组织学诊断及免疫组化评判。4.2.3免疫组化染色及判断标准4.2.3.1 ALK-D5F3ALK-D5F3工作液,使用Ventana全自动免疫组化染色机染色。阳性者为肿瘤细胞中存在强的颗粒状胞浆染色,排除已知的染色因素,包括肺泡巨噬细胞胞浆中较淡的点彩状染色、神经纤维及神经节细胞、浸润的淋巴细胞、坏死物及粘液等；ALK-D5F3阴性对照：肿瘤细胞内不存在强的颗粒状胞浆染色。4.2.3.2 p63p63原液,1：200稀释度,使用Ventana全目动免疫组化机染色。P63阳性染色定义为明确的核着色,p63表达阳性标准为阳性细胞数目≥10%全部肿瘤细胞数。同时观察p63阳性细胞分布特点,分为两种：弥漫性及癌巢周边部“镶边状”分布。4.2.3.3 p40p40鼠单抗原液,1：200稀释度,使用Ventana全自动免疫组化机染色。p40染色与p63相同,为核阳性着色,p40表达阳性病例判断标准为阳性细胞数≥10%者。记录阳性细胞分布特点,分为两种：弥漫性及癌巢周边部分布。4.2.3.4 TTF-1TTF-1鼠单抗原液,1：200稀释度,使用Ventana全自动免疫组化机染色。TTF-1为核阳性着色。阳性细胞数≥10%者判断为阳性,其余的为阴性。4.2.3.5 Ki-67Ki-67克隆号MIB-1抗体原液,1：200稀释度,使用Ventana全自动免疫组化机染色。Ki-67为核阳性着色,计算方法为Ki-67指数,即核阳性细胞占所有肿瘤细胞的百分数。4.2.3.6 SMASMA单抗原液1：100稀释度,使用前述手工免疫组化染色流程,阳性着色表现为胞浆内较强的棕黄色着色。对于阳性者,同时观察其细胞分布特点,包括弥漫性分布或在肿瘤细胞巢周围环绕状分布。4.2.3.7 ERCC1ERCC1鼠单抗原液,稀释度1：300,使用前述手工免疫组化染色流程,阳性着色为核阳性着色。ERCC1核表达分为四级：无任何阳性细胞或10%阳性,得分为0;10%核隐隐／几乎难以察觉的部分肿瘤细胞表达者,得分1+；10%肿瘤细胞核呈中等强度染色得分2+;10%肿瘤细胞核呈强阳性染色,得分3+。本研究采用两级标准：2+或3+分为阳性,0分或1+为阴性。4.2.3.8 Beta-tubulinBeta-tubulin鼠单抗原液,稀释度1：100,使用前述手工免疫组化染色流程,阳性着色为胞浆棕黄色着色。Beta-tubulin表达评分为为4级,胞浆无着色者为0分：较弱的刚刚能观察到的10%的肿瘤细胞胞浆着色为1+；10%肿瘤细胞弱到中等强度着色为2+；10%肿瘤细胞强胞浆着色为3+；本研究采用两级分类标准,0和1+为阴性,2+及3+为阳性。4.2.4 ALK-FISH商用的ALK基因的断裂-分离双色探针按照制造商的说明进行染色。该5'ALK探针标记SpectrumGreen,3'ALK探针标记SpectrumOrange。染色在组织芯片的石蜡切片上进行。用荧光显微镜在100X油镜下,每例观察至少100个非重叠的细胞内的杂交信号。ALK-FISH阳性的标准为100个分析细胞中,大于等于15个细胞显示ALK基因的荧光探针的侧面分离,红绿信号分离的距离超过2个信号直径。如果阳性细胞数介于5-15之间,则需另外计数100个细胞,若大于等于15个阳性细胞,仍可视为ALK FISH阳性。4.2.5统计分析使用SPSS 19.0统计学软件,计数资料使用非参数的卡方检验,计量资料使用t检验,方差不齐时使用秩和检验。5研究结果5.1中央型气道非小细胞肺癌的病理及临床特点5.1.1病理组织学类型的构成,鳞癌69例,占63.3%,涎腺型癌27例,占24.8%,腺癌10例,占9.2%,其他的腺鳞癌2例、癌肉瘤1例。涎腺型癌中,腺样囊性癌最多见,占55.6%,肌上皮癌占22.2%,涎腺腺癌(非特指)占14.8%,其中肌上皮癌有涎腺腺癌(非特指)为罕见的原发于肺的涎腺型癌。5.1.2临床病理特点：老年、男性、吸烟病人以鳞癌为主；年轻、女性、不吸烟病人以涎腺型癌为主。5.2中央型气道非小细胞肺癌的中医证候及分布特点5.2.1本组共109例肺癌中,气虚痰湿证36例,阴虚热毒证12例,气阴两虚证40例,气血瘀滞证21例；从其分布特点来看,鳞癌及涎腺型癌患者中,以气阴两虚证为最多见,分别占41.4%及40.7%；腺癌中以气虚痰湿证为最多见,占50%。5.2.2中医证候与年龄、性别、吸烟史及卡氏评分等均相关,老年病人、男性、有吸烟史、卡氏评分高于60分者,均以气阴两虚证为主；而年轻病人、女性、无吸烟史、卡氏评分低于60分者,多以气虚痰湿证候为主。5.3免疫组化鉴别诊断及与中医证候的关系5.3.1 p63不同中医证候间p63阳性表达率有极显著性差异(P0.01),其中在气阴两虚证候中阳性率为97.5%,而在阴虚热毒证病人中阳性率较低,约66.7%。p63在不同病理组织学类型癌中表达有极显著性差异(P0.01),其中在鳞癌中的表达率100%,腺癌中无一例阳性表达,涎腺型癌中阳性率约81.5%。p63在鳞癌、肌上皮癌中呈弥漫性／弥散性表达,但在腺样囊性癌、粘液表皮样癌中,呈癌巢周围“镶边状”分布。弥漫性p63阳性对于诊断鳞癌的敏感性为100%,特异性为82.5%;p63"镶边状”阳性对于腺样囊性癌和粘液表皮样癌诊断的特异性及敏感性均为100%。5.3.2 p40不同中医证候间p40阳性表达率有极显著性差异(P0.01),其中气阴两虚证阳性率高(97.5%),而阴虚热毒证病人阳性率较低(58.3%)。p40在不同病理组织学类型癌中表达有极显著性差异(P0.01),其中在鳞癌中的表达率100%,腺癌中无一例阳性表达,涎腺型癌中阳性率约77.8%。p40在鳞癌、肌上皮癌中呈弥漫性／弥散性表达,但在腺样囊性癌、粘液表皮样癌中,呈癌巢周围“镶边状”分布。弥漫性p40阳性对于诊断鳞癌的敏感性为100%,特异性为90.0%; p40“镶边状”阳性对于腺样囊性癌和粘液表皮样癌诊断的特异性及敏感性均为100%。5.3.3 TTF-1TTF-1在鳞癌无一例表达,腺癌阳性率为50%,涎腺型癌有2例个别细胞阳性,但10%,未达到阳性标准；TTF-1对腺癌诊断的敏感性为50%,特异性为100%。5.3.4 SMASMA在鳞癌及腺癌中无一例表达。在肌上皮癌中,呈弥漫性阳性表达(100%),在腺样囊性癌中,为癌巢周围“镶边状”阳性表达,阳性率93.3%。“镶边状"SMA阳性对腺样囊性癌+粘液表皮样癌诊断的敏感性为94.1%,特异性为100%。5.3.5 Ki-67Ki-67指数在涎腺型癌与非涎腺型癌两组之间比较有极显著性差异,涎腺型癌的Ki-67指数平均数显著低于非涎腺型癌者。5.3.6 ERCC1与Beta-tubulinERCC1阳性率在不同中医证候病例间有极显著性差异(P0.01),在气虚痰湿证及气血瘀滞证中阳性率较高,而在阴虚热毒证中表达较低。Beta-tubulin阳性率在不同病理组织学类型间有极显著性差异(P0.01),在腺癌中阳性率较高,而在涎腺型癌中表达较低。5.4 ALK免疫组化及ALK-FISH通过免疫组化和FISH的方法,共检测出3例ALK阳性肺癌,其中腺癌2例,占20%,鳞癌1例,占1.45%。6结论6.1明确了中央型气道非小细胞肺癌的中医证候分布及临床特征：男性、吸烟、鳞癌病人多为气阴两虚证,女性、不吸烟、涎腺型癌／腺癌病人,多为气虚痰湿证或阴虚热毒证。6.2 ERCC1在气虚痰湿证及气血瘀滞证中阳性率高,在阴虚热毒证中表达较低；Beta-tubulin在腺癌中表达最高,其次是鳞癌,在涎腺型癌中表达最低。ERCC1及Beta-tubulin的表达检测可为选择化疗药物、判断病人预后有参考价值。6.3阐明了中央型气道非小细胞肺癌有其独特的临床病理特点,包括：①主要由鳞癌、涎腺型癌、腺癌3种组织学类型；②涎腺型癌占很高的比例；③有肌上皮癌、涎腺腺癌(非特指)等少见类型；④老年、男性、吸烟病人以鳞癌为主;年轻、女性、不吸烟病人以涎腺型癌为主。6.4证实了p40/TTF-1/SMA三种抗体作为高效的组合,可以鉴别中央型气道非小细胞肺癌的组织类型：①鳞癌：p40弥漫性／弥散性(+),TTF-1(-),SMA(-);②腺癌：p40阴性,TTF-1(+)或(-),SMA(-)；③腺样囊性癌／粘液表皮样癌：p40及SMA癌巢周“镶边状”(+),TTF-1(-),个别散在弱(+)；④肌上皮癌：SMA(+),p40部分弥散性(+),TTF-1(-)；⑤涎腺腺癌,非特指：p40阴性,SMA阴性,TTF-1(-)；⑥p40对鳞癌诊断的特异性高于p63;⑦涎腺型癌的Ki-67指数低于鳞癌及腺癌。6.5 中央型气道腺癌、鳞癌均有ALK基因重排,适合选择分子靶向药物治疗。涎腺型癌中未发现有ALK的基因重排异常。7创新点7.1首次以中央型气道非小细胞肺癌为研究对象,阐明了不同不医证候各自的组织学特点及临床特征,从而为更有针对性地中西医治疗提供理论基础；7.2找到了一个最佳抗体组合,用以鉴别诊断中央型气道非小细胞肺癌的各种组织学类型,并研究了ERCC1, Beta-tubulin, ALK等治疗靶标在不同类型癌中的表达特点及最优的化疗药物选择方案。
【图文】：

肺腺癌,肺鳞癌,信号通路,基因

图２肺淲癌、肺腺癌中的主要信号通路及其功能逡逑引自视她，ＢＡ，Ｈｕｇｈｅｓ，邋ＢＧ邋Ｔｒａｎｓｌ邋Ｌｕｎｇ邋Ｃａｎｃｅｒ邋２０１５，，４（１）３６－５因子受体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ邋ｇｒｏｗ化邋ｆａｄｏｒ邋ｗｅｅｐ化ｒ，ＥＧＦＲ）逡逑的分布与功能逡逑

功能图,信号通路,表皮生长因子受体,肺腺癌

发现有已知的驱动基因突变，见图ｉＰ４１。涉及的主要信号通路包括逡逑ＲＡＳ－ＲＡＦ－ＭＥＫ－ＥＲＫｓ邋ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－邋ｍＴＯ民或邋ＪＡＫ－ＳＴＡＴ邋通路等，见逡逑图２。通过使用小分子抑制物或受体的单克隆抗体，从而抑制上调的信号通路，逡逑继而获得很好的X1向治疗效果。其中目前使用最广的分别是针对ＥＧＦＲ和ＡＬＫ信逡逑号通路的祀向治疗。逡逑４０逡逑
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

【参考文献】