环化变构TRAIL联合5-FU抗结直肠癌作用研究

发布时间：2020-06-13 05:57

【摘要】：结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率逐年升高,已经成为了世界范围内肿瘤相关死亡的主要原因之一。在我国,随着社会经济的发展,居民生活方式的转变,以及人口老龄化的加剧,CRC的发病和死亡均呈明显上升的趋势,且发病年龄有年轻化的趋势。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是临床上最常用的治疗转移性结直肠癌((metastatic colorectal cancer,mCRC)的化疗药物之一,但是,固有或获得性耐药等因素阻碍了其充分发挥抗肿瘤作用,mCRC患者的预后仍然较差,5年生存率不到10%。因此,寻找有效的CRC治疗策略具有重要的意义。联合用药是克服耐药的有效方法,而对联合作用的具体分子机制的深入理解是开发更好的联合疗法的关键所在。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)能够诱导多种恶性肿瘤细胞和转化细胞凋亡,对正常组织和细胞无明显毒性。有研究表明,细胞毒性药物、放射线、分子靶向药物等与TRAIL联用能增强其诱导多种恶性肿瘤细胞凋亡的作用,并且能逆转恶性肿瘤细胞对TRAIL的耐药性。环化变构TRAIL(circular permuted TRAIL,CPT)或称为重组变构人TRAIL(recombinant mutant human TRAIL,rmh TRAIL)是由野生型TRAIL结构优化而产生,其稳定性、溶解性、抗肿瘤活性和安全性均优于野生型TRAIL,研究显示CPT对多种非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞具有显著的抑制作用,而对人正常细胞则无毒性;CPT与顺铂(cisplatin,DDP)联合应用对NSCLC细胞系的生长抑制作用明显加强或表现为协同作用,而对正常人细胞不表现明显的毒性,体内试验也得出了类似的结果。此外,多项研究已证明,CPT已经成为一种有潜力的治疗多发性骨髓瘤的药物。以上均显示出CPT具有良好的抗肿瘤治疗前景。然而,迄今为止,有关CPT在结直肠癌中的研究尚未见报道。在本研究中,我们首次观察了CPT单药及CPT与5-FU联用对人CRC细胞增殖及凋亡的作用,并对诱导凋亡的相关分子机制进行了探讨;通过建立CRC细胞HCT116荷瘤裸鼠模型,观察了CPT与5-FU联用对裸鼠成瘤能力的影响,并应用TUNEL/DAPI染色法检测了CPT与5-FU联用对CRC移植瘤细胞凋亡的影响。本研究的主要目的在于明确:(1)CPT单药是否能够抑制CRC细胞的增殖并诱导CRC细胞凋亡;(2)CPT与5-FU联用能否增强抗肿瘤效果;5-FU能否增加CRC细胞对CPT的敏感性;(3)CPT与5-FU联合抗肿瘤作用的分子机制;(4)CPT与5-FU联用的体内抗肿瘤效果如何。研究结果将为今后开展CPT治疗CRC的临床试验提供实验依据,为将来临床上应用此联合方案治疗晚期CRC作为新的治疗方式奠定基础。本研究分以下三部分:第一部分环化变构TRAIL联合5-FU抑制人结直肠癌细胞增殖及诱导其凋亡的作用目的:观察CPT和/或5-FU对人CRC细胞HCT116和SW480体外增殖及凋亡的影响。方法:1.细胞增殖抑制实验将CRC细胞HCT116和SW480分别接种于96孔板,每株细胞分为不同浓度的5-FU组和不同浓度的CPT组,待24h细胞过夜贴壁后,分别用不同浓度的5-FU处理48h,用不同浓度的CPT处理12、24或48h。然后加入MTS,继续培养3h,用酶标仪检测各孔吸光度值(OD值),根据公式计算出各时间点的细胞增殖抑制率,进一步得到半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50),IC50为细胞生长抑制达50%时的药物浓度。CPT与5-FU联用对CRC细胞的增殖抑制作用:将CRC细胞HCT116和SW480分别接种于96孔板,待24h细胞贴壁后,HCT116细胞用5μg/mL的5-FU联合不同浓度的CPT共同作用48h;SW480细胞用12.5μg/mL的5-FU联合不同浓度的CPT共同作用48h,然后加入MTS继续培养3h,用酶标仪检测各孔OD值,根据公式计算出两株CRC细胞的增殖抑制率。2.流式细胞术检测两株CRC细胞的凋亡率将CRC细胞HCT116和SW480以5×10~5个/孔的密度分别接种于6孔板,每株细胞分为六组:对照组、5-FU组、CPT低浓度组、CPT高浓度组、5-FU+CPT低浓度组和5-FU+CPT高浓度组,细胞过夜贴壁后分别加入CPT和/或5-FU处理24h或48h,收集细胞,用Annexin V-FITC和PI双染细胞,室温下避光反应5分钟,用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:1.CPT或5-FU单药对两株CRC细胞均有明显的增殖抑制作用MTS结果显示:不同浓度的5-FU单药分别作用于CRC细胞HCT116和SW480 48h,能明显抑制两株细胞的增殖,细胞的增殖抑制率随5-FU浓度的增大而增加,呈浓度依赖效应(P0.001)。不同浓度的CPT单药分别作用于CRC细胞HCT116和SW480 12、24或48h,MTS结果显示:CPT单药对CRC细胞HCT116和SW480具有明显的增殖抑制作用,随着CPT浓度的增大,细胞的增殖抑制率逐渐增加,随着作用时间的延长,细胞的增殖抑制率也增加,呈时间和浓度依赖效应(P0.001)。在48h,CPT对CRC细胞HCT116和SW480的IC50值分别为8.49 ng/mL和338.43 ng/mL。2.CPT与5-FU联用对两株CRC细胞的增殖抑制作用明显增强CPT与5-FU联合作用于CRC细胞HCT116和SW480 48h,结果显示,联合用药组的细胞增殖抑制率明显高于单药CPT或5-FU组,差异均有显著性(P0.001)。3.5-FU能增强CPT诱导CRC细胞凋亡的作用流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,无论5-FU还是CPT单药均能诱导CRC细胞HCT116和SW480凋亡;当CPT与5-FU联用时,两株细胞的凋亡率均明显高于单药组,差异均有显著性(P0.05)。两株细胞在CPT高浓度组的凋亡率高于低浓度组,差异均有显著性(P0.05)。各药物处理组细胞在48h的凋亡率均高于24h的凋亡率,差异均有显著性(P0.05)。小结:1.CPT单药能抑制CRC细胞HCT116和SW480增殖,且增殖抑制作用呈时间和浓度依赖效应;5-FU单药对CRC细胞HCT116和SW480具有明显的增殖抑制作用,呈浓度依赖效应;2.CPT与5-FU联用对CRC细胞HCT116和SW480的增殖抑制作用显著增强;3.CPT单药能诱导CRC细胞HCT116和SW480发生凋亡;CPT与5-FU联用诱导CRC细胞HCT116和SW480凋亡的作用明显增强。第二部分环化变构TRAIL联合5-FU诱导人结直肠癌细胞凋亡机制探讨目的:探讨CPT联合5-FU诱导人CRC细胞凋亡的作用机制。方法:1.Western blot法检测CPT联合5-FU对CRC细胞凋亡信号通路中相关蛋白表达的影响将CRC细胞HCT116和SW480分别以5×10~5个/孔的密度接种于6孔板中,每株细胞分四组:对照组、5-FU组、CPT组、5-FU+CPT组,细胞过夜贴壁后分别加入5-FU和/或CPT处理48h,然后裂解细胞收集蛋白,行蛋白定量,用10%SDS-PAGE分离蛋白、转膜、5%脱脂奶粉封闭、一抗4℃过夜孵育、二抗常温孵育1.5h,用ECL试剂进行显色,采用化学发光成像系统分析相关蛋白的表达情况。2.流式细胞术检测广谱caspase抑制剂z-VAD-FMK对CPT或CPT联合5-FU诱导CRC细胞凋亡的影响应用广谱caspase抑制剂z-VAD-FMK分别处理CRC细胞HCT116和SW480 1h后,各实验组加入CPT或CPT联合5-FU继续作用48h,收集细胞,用Annexin V-FITC和PI双染细胞,室温下避光反应5min,用流式细胞术检测细胞凋亡率。3.Western blot法检测广谱caspase抑制剂z-VAD-FMK对CPT或CPT联合-5FU诱导的CRC细胞凋亡信号通路中相关蛋白表达的影响应用广谱caspase抑制剂z-VAD-FMK分别处理CRC细胞HCT116和SW480 1h后,各实验组加入CPT或CPT联合5-FU继续作用48h,然后裂解细胞收集蛋白,行蛋白定量,用10%SDS-PAGE分离蛋白、转膜、5%脱脂奶粉封闭、一抗4℃过夜孵育、二抗常温孵育1.5h,用ECL试剂进行显色,采用化学发光成像系统分析相关蛋白的表达情况。结果:1.CPT与5-FU联用对凋亡信号通路中相关蛋白表达的影响1.1 CPT与5-FU联用能诱导CRC细胞发生caspase依赖性的凋亡Western blot结果显示,CPT单药能导致两株CRC细胞中caspase-3、caspase-8和PARP的表达水平下降,而使cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP的裂解片段表达水平升高;与CPT单药组相比,联合用药组两株细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP的裂解片段表达水平明显升高。另外,CPT与5-FU联用能导致两株CRC细胞中caspase-9的表达水平下降,但没有检测到裂解形式的caspase-9的表达。1.2 5-FU作用于CRC细胞能引起死亡受体(DRs)的表达上调不同浓度的5-FU分别作用于CRC细胞HCT116和SW480 48h,应用Western blot法检测死亡受体4(DR4)和DR5的表达情况,结果显示:5-FU能明显上调HCT116细胞中DR4和DR5的表达,而在SW480细胞,5-FU只能引起DR4的表达上调,与对照组相比差异均有显著性(P0.001)。1.3 CPT与5-FU联用能下调CRC细胞Bcl-XL的表达水平CPT和/或5-FU作用于CRC细胞HCT116和SW480 48h后,用Western blot法检测BAX、Bcl-XL和XIAP蛋白的表达情况,结果显示:CPT与5-FU联用使Bcl-XL的表达水平下降,而对BAX和XIAP的表达水平无明显影响。2.广谱caspase抑制剂z-VAD-FMK能抑制CPT或CPT联合5-FU诱导的CRC细胞凋亡流式细胞术检测细胞凋亡结果显示:广谱caspase抑制剂z-VAD-FMK能明显抑制CPT或CPT联合5-FU诱导的两株CRC细胞凋亡。HCT116细胞加或不加z-VAD-FMK处理,CPT组的凋亡率分别为16.3±0.4%和59.9±0.9%,CPT联合5-FU组的凋亡率分别为33.6±2.4%和90.8±0.8%,差异均有显著性(P0.001);SW480细胞加或不加z-VAD-FMK处理,CPT组的凋亡率分别为18.9±0.5%和43.7±0.2%,CPT联合5-FU组的凋亡率分别为29.7±0.2%和69.6±0.9%,差异均有显著性(P0.001)。3.广谱caspase抑制剂z-VAD-FMK能够阻断CRC细胞中凋亡信号的传导Western blot结果显示:CPT单药或CPT与5-FU联用能明显上调cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP蛋白的裂解片段在CRC细胞HCT116和SW480中的表达,当加入z-VAD-FMK后,这种裂解作用明显受到抑制。结果表明,CPT或CPT联合5-FU诱导CRC细胞凋亡是caspase依赖性的。小结:1.CPT及CPT与5-FU联用诱导CRC细胞凋亡是caspase依赖性的;2.5-FU通过上调DRs的表达及下调Bcl-XL的表达来增强CPT诱导CRC细胞凋亡的作用及增加CRC细胞对CPT的敏感性;3.广谱caspase抑制剂z-VAD-FMK能显著抑制CPT单药或CPT与5-FU联用诱导的CRC细胞凋亡;4.广谱caspase抑制剂z-VAD-FMK能使cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP蛋白的裂解片段表达水平明显下降,有效阻断了caspase介导的细胞信号转导;5.Caspase家族蛋白酶在CPT及CPT联合5-FU诱导CRC细胞凋亡中起了关键作用。第三部分环化变构TRAIL联合5-FU体内抗肿瘤作用目的:建立人CRC荷瘤裸鼠模型,观察CPT与5-FU联用在体内的抗肿瘤效果。方法:1.建立CRC细胞HCT116荷瘤裸鼠模型取处于对数生长期的CRC细胞HCT116,调整细胞浓度为5×10~7个/mL,接种于6周龄雌性BALB/C裸鼠右侧腋窝中部皮下,每只裸鼠接种6×10~6个细胞。待肿瘤生长至100-120mm~3时,随机分为5组,每组5只裸鼠,并给药处理,自用药当天开始,每5天测量裸鼠体重、并测量瘤径,按公式计算肿瘤体积,瘤体积=1/2×长径×短径~2。第25天,处死裸鼠,剥取瘤组织称重并拍照。每只裸鼠的肿瘤组织分为两份,一份保存于液氮,另一份用30%蔗糖溶液浸泡后制成冰冻切片。2.TUNEL/DAPI法检测裸鼠移植瘤细胞的凋亡情况用冰冻切片机连续切片,每片3μm,然后进行TUNEL/DAPI染色,最后利用激光共聚焦显微镜观察裸鼠移植瘤的细胞凋亡情况,并拍照。结果:1.CPT联合5-FU对荷瘤裸鼠生长状态的影响实验过程中,荷瘤裸鼠精神状态良好,生长状态良好,饮食及活动正常;裸鼠肿瘤表面皮肤无溃烂,各组动物均无死亡,各组裸鼠体重间无明显的差别(P0.05)。表明CPT和5-FU无论单独用药还是两者联合对荷瘤裸鼠均未引起明显的不良反应,耐受良好。2.CPT联合5-FU对人CRC荷瘤裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用CPT和5-FU单药均能抑制裸鼠移植瘤的生长,与对照组比较差异均有显著性(P0.001),而两药联合对裸鼠移植瘤的生长抑制作用更加显著,并且以高浓度的CPT(7.5mg/kg)与5-FU联合组最为显著,与其它组比较差异有显著性(P0.001),且两联合组之间差异也有显著性(P0.01)。3.CPT联合5-FU促进了荷瘤裸鼠移植瘤细胞的凋亡TUNEL/DAPI染色法检测移植瘤细胞凋亡结果显示:CPT、5-FU及CPT联合5-FU均能导致裸鼠移植瘤细胞发生凋亡,但联合组诱导凋亡的作用显著强于单药组(P0.001),并且高浓度的CPT与5-FU联合诱导凋亡的作用最为显著。小结:1.CPT与5-FU联用对CRC细胞HCT116荷瘤裸鼠的肿瘤具有显著的生长抑制作用,并且高浓度CPT与5-FU联用抑制肿瘤生长的作用更强;荷瘤裸鼠对该用药方案耐受性良好,无明显不良反应发生;2.CPT与5-FU联用对CRC细胞HCT116荷瘤裸鼠的肿瘤细胞有促进凋亡的作用。结论:1.CPT单药在体外能抑制CRC细胞增殖并诱导其凋亡;CPT与5-FU联用能增强对CRC细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用;2.CPT及CPT与5-FU联用诱导CRC细胞凋亡是caspase依赖性的;3.5-FU通过上调DRs的表达及下调Bcl-XL的表达来增强CPT诱导CRC细胞凋亡的作用及增加CRC细胞对CPT的敏感性;4.CPT单药能抑制CRC荷瘤裸鼠移植瘤的生长,CPT与5-FU联用对裸鼠移植瘤的生长抑制作用明显增强;CPT与5-FU联用促进了CRC荷瘤裸鼠肿瘤细胞的凋亡。
【图文】：

细胞,浓度

32同浓度 5-FU 对 CRC 细胞 HCT116 和 SW480 的增lorectal cancer cell lines HCT116 and SW480 were tre concentrations of 5-FU for 48 h, after which the MTSperformed to evaluate cell proliferation inhibition rate

细胞,浓度

33同浓度 CPT 对 CRC 细胞 HCT116 和 SW480 的增T116 and SW480 cells were treated with various doed for 12, 24, or 48 h. Then, the MTS assay was perfhe cell proliferation inhibition rate.△P<0.001 versufor 12 h;#P<0.001 versus cells treated for 12 or 24 h
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

【参考文献】