Notch信号对EMT的调控及其在口腔鳞癌转移中的作用机制研究

发布时间：2020-06-13 05:59

【摘要】：研究背景和目的:口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一。近年来,新的医疗技术和治疗方法不断涌现,有效的提高了肿瘤的局部控制率,但口腔癌患者的5年生存率并没有下降的趋势,仍高达50-55%。该疾病的死亡率仍高居不下,其原因主要是口腔鳞癌具有局部侵袭和远处转移能力。所以对于口腔鳞癌患者的转移机制的研究成为目前研究的重中之重,阐明肿瘤发生转移的具体机制并且采取有效的措施遏制转移对于改善口腔鳞癌患者的预后和治疗具有重要意义。上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是一种复杂的生物学过程,在胚胎发生、伤口愈合和恶性肿瘤的转移中均具有重要的意义。它可以选择已有的细胞电位,从而促进或抑制细胞增殖、死亡,获得特定的细胞命运和激活分化程序,发育和维持自我更新的成人组织,因此在各种组织发育的过程中Notch扮演着关键作用。随着对Notch信号通路研究的不断深入,发现该通路与EMT有关,其不仅参与了生物个体的发育过程,还参与肿瘤的发生、发展过程。Notch信号通路的激活可诱导EMT的发生,但是这种信号转导及其与EMT在口腔鳞状细胞癌细胞运动中的关系仍不清楚。因此,本研究的目的主要以口腔鳞癌细胞系Tca8113和CAL27为模型,探讨Notch信号通路和EMT的关系及在OSCC转移中的作用机制。研究方法:(1)通过RNA干扰技术抑制口腔鳞癌细胞系Tca8113和CAL27中Snail基因的表达,使用qRT-PCR实验技术检测Snail-si RNA转染后Tca8113和CAL27细胞中Snail、E-cadherin、Vimentin基因的mRNA表达水平;同时采用Western-blot检测转染后两种细胞系中Snail、E-cadherin、Vimentin基因的蛋白表达水平;并采用Transwell实验和划痕实验,分别检测在Tca8113和CAL27细胞中降低Snail基因的表达对细胞迁移能力的影响,从而探讨Snail及EMT相关基因对口腔鳞癌的影响。(2)使用DAPT阻断Notch信号通路,用MTT法检测不同剂量(1?40umol/L)DAPT对Tca8113和CAL27细胞的生长和活力的影响;根据MTT实验结果,选用1 umol/L和5 umol/L浓度的DAPT处理两种细胞24h和48h,采用qRT-PCR方法检测DAPT阻断Notch信号通路后两种细胞Hes1、Snail、Vimentin和E-cadherin基因的mRNA表达水平;同时采用Western-blot检测N1ICD、Snail、E-cadherin、Vimentin基因的蛋白表达水平;并采用Transwell实验和划痕实验分别检测DAPT阻断Notch信号通路后两种细胞的迁移能力,从而探讨Notch信号通路与EMT的关系及对口腔鳞癌的影响。研究结果:(1)qRT-PCR和Western-blot结果均显示siRNA技术能够有效抑制Tca8113和CAL27细胞Snail的mRNA和蛋白表达水平,同时Vimentin表达减少,而E-cadherin表达增加;同时,Transwell实验和划痕实验结果均显示,沉默Snail基因也显著抑制了Tca8113和CAL27两种OSCC细胞的迁移能力。(2)1umol/L、2 umol/L、5umol/L浓度的DAPT作用于Tca8113和CAL27细胞24h和48h后,对细胞的增殖率无明显影响;而10umol/L、20 umol/L、40umol/L浓度的DAPT作用于两种细胞24h、48h、72h、96h、120h可显著降低细胞的增殖率,且呈现明显的时间与剂量依赖关系。qRT-PCR和Western-blot结果均显示,使用1 umol/L和5 umol/L的DAPT阻断Notch信号通路后,能够下调两种细胞Snail和Vimentin和上调E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平;同时,Transwell实验和划痕实验结果均显示,DAPT阻断Notch信号通路后Tca8113和CAL27细胞的的迁移能力明显降低。结论:(1)抑制Snail基因在口腔鳞癌细胞中的表达,细胞的迁移能力减弱;(2)Notch信号通过对EMT的调控促进口腔鳞癌细胞发生转移。
【图文】：

慢病毒

目的慢病毒载体载体名称：GV248元件顺序：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin对照编号：CON077对照插入序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT2）慢病毒的包装病毒包装共涉及三个质粒，分别为：①携带目的基因靶点序列的工具载粒；②病毒包装辅助质粒（Helper 1.0）；③病毒包装辅助质粒（Helper 2.0验中采用三质粒共转染 293T 细胞，在转染完成后的 72h 进行病毒收获（即化的细胞上清液），根据实验需求，，采用相应的浓缩纯化方法以得到高滴慢病毒保存液，最后根据严格的质量标准测定慢病毒的各项指标。慢病毒的流程如图 1-1 所示。

转染,转染效率,荧光显微镜,情况

2 结果2.1 Snail-siRNA 干扰对口腔鳞癌细胞迁移能力的影响2.1.1 倒置荧光显微镜下观察转染效率慢病毒载体自带绿色荧光蛋白 GFP 标记的 Snail-siRNA 转染后 96h 于倒置荧光显微镜下观察GFP 标记的 siRNA转染情况。分别如图 2-1和2-2所示，Tca8113 和CAL27细胞转染率均达到 80％以上，且两种细胞均对 LV-SNAI1-RNAi(7368-1)的转染效率最佳。
【学位授予单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.8

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