应用力学模型研究肾透明细胞癌微环境中淋巴细胞与肿瘤生长介导的压力对肿瘤细胞作用的分子机制

发布时间：2020-06-13 18:33

【摘要】：肿瘤微环境由肿瘤细胞、间质细胞及细胞外基质共同构成,但目前关于肿瘤微环境的研究多注重模拟微环境中生物化学因素,忽略真实体内生物力学因素影响,故其结果的可靠性有待证实。因此,如果能够利用力学模型加入生物化学因素的刺激,不但能够进一步模拟体内的微环境,观察肾透明细胞癌发生发展的过程,还将进一步准确揭示生物化学及生物力学因素对肾透明细胞癌转移的分子机制,更主要的是挑战传统肿瘤微环境的观点限制,为进一步肿瘤治疗提出新的观点和手段。本研究拟借助力学模型构建体内肿瘤微环境,研究肾透明细胞癌微环境中淋巴细胞与肿瘤生长介导的压力对肿瘤细胞作用的分子机制,本研究旨在为肾透明细胞癌转移及治疗寻找新的治疗方向,本研究分为以下三部分。研究方法:1.应用PCR Array技术筛选肿瘤微环境中关键变化组分以及其对肿瘤细胞的作用通过自行设计肿瘤微环境相关成分PCR Array,筛选正常肾组织与肾肿瘤组织微环境差异成分CD4;通过免疫组化、临床随访、共聚焦技术以及肿瘤功能学实验等进一步筛选关键变化组分;为明确微环境中影响肾癌进展的关键组分以及进一步可能的机制提供依据。2.借助力学模型运用基因表达谱技术筛选生物化学及生物力学联合作用下微环境中促进肾透明细胞癌进展的关键蛋白基于力学模型构建肿瘤微环境模型,运用全基因表达谱技术验证生物力学因素对肿瘤影响;在此基础上,加入微环境生物化学成分变化因素IL-6,进一步构建仿生肿瘤微环境,再现肾透明细胞癌发生发展过程,为后续微环境影响肾透明细胞癌进展分子机制提供技术平台及理论依据。3.肿瘤微环境中促进肾透明细胞癌进展的关键分子及通路验证性研究应用生物力学平台,验证基因表达谱芯片筛选出的β-catenin、CD44为代表的关键蛋白在肾透明细胞癌进展中的作用,进一步证实调控关键蛋白的信号通路,以此为治疗肾透明细胞癌提供新的思路及理论基础。结果:1.应用PCR Array技术筛选肿瘤微环境中关键变化组分以及其对肿瘤细胞的作用通过自行设计的肿瘤微环境PCR Array,我们对比正常肾组织与肾癌组织发现微环境中CD4及上皮间质化(epithelial to mesenchymal transition EMT)组分变化明显;进一步利用免疫组化我们发现与低级别肾癌相比,高级别中CD4及上皮间质化标记物α-SMA表达明显增高,并且两者存在正相关性,因而我们进一步研究两者在肾癌中的关系,体外流式细胞仪提取人原代CD4(+)T细胞与肿瘤细胞共培养,通过ELISA测定培养液中IL-6含量变化显著增高。然后体外IL-6刺激肾癌肿瘤细胞,通过共聚焦显像及蛋白水平变化发现肿瘤细胞发生上皮间质化现象,并且促进肿瘤细胞的侵袭迁移。为明确微环境中影响肾癌进展的关键组分以及进一步可能的机制提供依据。2.借助力学模型运用基因表达谱技术筛选生物化学及生物力学联合作用下微环境中促进肾透明细胞癌进展的关键蛋白肿瘤微环境中不仅存在生物化学因素,还有生物力学发挥作用,我们体外构建生物力学微环境模型,实现力学和化学连续动态刺激肿瘤细胞,通过细胞活性及迁移实验,明确肿瘤细胞微环境压力范围;在此基础上,我们通过基因表达谱芯片对IL-6刺激组、生物力学刺激组及联合作用组进行差异基因的分析定量,同时根据GO(Gene Ontology)分析挑选出功能与上皮间质化及生物力学相关的分子,在肾癌细胞中进一步筛选出β-catenin关键蛋白,为后续微环境影响肾透明细胞癌进展分子机制提供技术平台及理论依据。3.肿瘤微环境中促进肾透明细胞癌进展的关键蛋白及通路研究选取关键蛋白β-catenin,借助生物力学平台进行干预,发现β-catenin能有效影响肾癌细胞上皮间质转化及细胞干性,而且与肾癌预后相关。同时,我们通过全基因表达谱芯片KEGG通路筛选出PI3K-Akt信号通路,基于蛋白水平验证肿瘤微环境通过物理化学作用调控Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路影响肾癌进展,以此为治疗肾透明细胞癌提供新的思路及理论基础。结论:1.本研究成功通过自行设计的肿瘤微环境PCR Array,筛选正常肾组织与肾肿瘤组织微环境差异组分CD4;并且通过免疫组化、临床随访、共聚焦技术以及肿瘤功能学实验等进一步筛选出CD4(+)T细胞分泌因子IL-6及其对肿瘤的影响。2.借助生物力学平台,明确合适的压力水平促进肿瘤细胞迁移能力增强,利用基因表达谱芯片证明压力存在仍能进一步加强IL-6作用,使肿瘤细胞恶性程度进一步升高,但是单纯的压力不能启动肿瘤细胞上皮间质化进程。3.肿瘤微环境通过生物力学及生物化学作用调控Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路影响肾癌进展,为肾癌治疗的提供新的思路。
【图文】：

其中 21 个基因是上调的，6个基因是下调的（图 1-1a）。继而我们将差异基因按照功能和种类进行分类（图1-1b），与正常肾脏组织相比，肿瘤组织上皮间质化相关基因（CXCR4，VIM，，ACTA2）明显上调；相似的，细胞外基质以及生物力学相关基因也显著表达升高（PLOD2，P4HA1，LOXL2，LOX

图 1-2 对 55 位不同级别肾透明细胞癌患者进行免疫组化染色，发现 α-SMA（+）细和 CD4（+）细胞数在 Fuhrman III-IV 组织增强，而 Collagen I 染色强度在 Fuhrman III-IV织减弱。图中比例尺 100μm，p < 0.05 有统计学意义。图 1-3 Spearman 关联分析 Collagen I 和 α-SMA（+）细胞数在肾癌组织中的关系，显Collagen I 和 α-SMA（+）细胞数呈负相关，关联系数 r = -0.348， p < 0.05 有统计学意义
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.11

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本文编号：2711572