circRAD18通过调控CDK6的表达促进三阴乳腺癌细胞的增殖

发布时间：2020-06-21 08:11

【摘要】：目的:三阴乳腺癌(TNBC)是一种侵袭性乳腺肿瘤,由于缺乏雌激素受体的表达和HER2/NEU基因的扩增而没有适合的作用靶点,因而化疗是最好的选择。但是由于TNBC病人对化疗药物的抗性,使得预后较差,并且伴有较高复发率和转移能力。最近研究发现circRNAs在肿瘤发生中发挥着重要的作用,然而circRNAs在TNBC中的作用还不是很清楚。方法:微阵列芯片分析筛选三阴乳腺癌病人组织和非癌组织、细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549以及正常乳腺上皮细胞MCF-10A中差异表达的环状RNA;设计circRAD18特异的反向剪接引物,Sanger测序验证其序列;生物信息学预测circRAD18靶向结合的miRNA,Targetscan、miRBase预测miR-1299、miR-498的共同靶基因;双荧光素酶报告基因验证mi R-1299、miR-498与CDK6的靶向关系;qRT-PCR检测circRAD18、CDK6、mi R-1299、miR-498的RNA表达水平;EdU增殖实验检测细胞增殖能力;细胞凋亡实验检测细胞的凋亡情况;平板克隆实验检测克隆形成能力;Transwell检测TNBC细胞的侵袭能力;细胞周期实验检测细胞的周期变化情况;Western blot检测CDK6、pRb、cyclinD1蛋白的表达情况。结果:微阵列分析筛选三阴乳腺癌组织和细胞中差异表达的circRNAs,其中circRAD18在TNBC组织和细胞系中均表达上调(差异倍数2),并将其命名为circRAD18。qRT-PCR检测结果显示,相比正常乳腺上皮细胞MCF-10A以及非三阴乳腺癌细胞系(MCF-7、BT474、Skbr3),circRAD18在TNBC细胞系(HCC38、MDA-MB-468、BT549、MDA-MB-231)中表达上调,表达存在统计学差异(p0.05,n=3)。circRAD18的三个干扰序列经检测si-circRAD-S1干扰效率最高。在TNBC细胞中,下调circRAD18的表达后,TNBC细胞的增殖能力、克隆形成能力以及侵袭能力显著降低,并能诱导细胞的凋亡。生物信息学分析发现circRAD18与miR-1299、miR-498有较高的结合率。qRT-PCR发现circRAD18敲低,miR-1299、miR-498表达降低,而mi R-1299、mi R-498表达抑制后并不影响circRAD18的表达。Targetscan、miRbase预测miR-1299、miR-498的靶基因,发现它们能够共同靶向CDK6。双荧光素酶报告基因显示mi R-1299、miR-498能够靶向CDK6,共转染miR-1299、mi R-498的mimics后效果更好。qRT-PCT显示转染mi R-1299、miR-498的inhibitor后CDK6表达升高,转染mimics后CDK6表达降低,其中共转染miR-1299、miR-498组效果更为显著。接着,共转染miR-1299、mi R-498的inhibitor或者mimics后,EdU增殖实验发现mi R-1299、miR-498表达抑制促进TNBC细胞增殖,过表达则抑制TNBC细胞的增殖;细胞周期显示mi R-1299、mi R-498表达抑制能够推进细胞周期向G2/S期转化,过表达则将细胞周期阻滞在G1期;Western blot发现mi R-1299、miR-498表达抑制后CDK6、pRb、cyclinD1蛋白表达升高,过表达则抑制CDK6、pRb、cyclinD1蛋白的表达。接着共转染si-circRAD18和mi R-1299、mi R-498的inhibitor,qRT-PCR检测发现共转染si-circRAD18和mi R-1299、miR-498的inhibitor能够恢复si-circ RAD18引起的CDK6 mRNA水平表达下调;EdU增殖实验发现共转染si-circRAD18和mi R-1299、miR-498的inhibitor能够在一定程度上恢复si-circ RAD引起的TNBC细胞增殖的抑制;细胞周期实验发现共转染si-circRAD18和mi R-1299、mi R-498的inhibitor能够恢复si-crc RAD18引起的细胞周期在G1期的阻滞;Western blot实验发现共转染si-circRAD18和mi R-1299、mi R-498的inhibitor能够恢复si-circRAD18引起的CDK6、cyclin D1、pRb表达降低。结论:1、circRAD18在三阴乳腺癌组织和细胞中表达上调;2、circRAD18在三阴乳腺癌细胞系中高表达,而在正常乳腺细胞、非三阴乳腺癌细胞系中表达没有差异;3、沉默circRAD18的表达,能够抑制TNBC的增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力,并诱导细胞的凋亡;4、circRAD18能够下调miR-1299、mi R-498的表达;5、mi R-1299、mi R-498能够共同靶向CDK6抑制细胞周期进程;6、circRAD18是通过下调miR-1299、miR-498的表达来调节CDK6,从而促进TNBC细胞的增殖能力。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

散点图,表达谱,细胞系,癌组织

As 在三阴乳腺癌组织和细胞中的表达谱先利用 circRNA 基因芯片筛选 TNBC 组织和非癌组织、细胞系对TNBC癌组织和非癌组织以及MDA-MB-231、MDA-MB-468的中差异表达的 circRNAs，发现多种 circRNA 在 TNBC 组织和所有的表达的 circRNAs 的分层聚类表明 circRNAs 在 TNBC 组（图 1A）。散点图和火山图（图 1B、C、）显示 TNBC 和 NTN 细胞系和正常乳腺上皮细胞之间 circRNA 表达的变化。我们总变倍数大于两倍的差异表达的 circRNA，其中三对病人组织中A 有 173 个，表达下调的有 77 个，在三株 TNBC 细胞系中都A 有 433 个，下调的有 657 个，综合病人组织和三株 TNBC 细组织和三株细胞系中均上调的 circRNA 有 11 个，下调的有 3 个达超过 2 倍的变化的 circRNA。

序列,基因组,位点,测序

27图 2 circRAD18 在 TNBC 中的表达A：circRAD18 的基因组位点,并利用 Sanger 测序进行验证，箭头表示与 circRAD18 的基组区域结合的不同引物。B：qRT-PCR 检测 circRAD18 在不同乳腺癌细胞系以及正常乳腺上细胞（MCF-10A）中的表达情况，结果表明 circRAD18 在 TNBC 细胞系中高表达。4.3 circRNA-RAD18 参与三阴乳腺癌细胞的病理进程为了评估 circRAD18 在 TNBC 中的生物学功能，我们构建了 circRNA 特异的干扰序列来沉默 TNBC 细胞 MDA-MB-231、HCC38 中 circRAD18 的表达。

【参考文献】