表柔比星和小檗碱对涎腺腺样囊性癌ACC2细胞系增殖，凋亡，自噬的影响

发布时间：2020-06-21 18:13

【摘要】：背景:涎腺腺样囊性癌是发生于腮腺,颌下腺,舌下腺以及小唾液腺的肿瘤,恶性程度高,是唾液腺最常见的恶性肿瘤之一。涎腺腺样囊性癌的发生常会影响唾液腺的分泌,致使口腔干燥,进食困难,疼痛明显,又因好发于颌面部,常会影响患者的美观,极大的降低了患者的生活质量。目前涎腺腺样囊性癌的治疗以手术切除为主,辅以术后放疗和化疗,但是,其复发率较高。为了降低涎腺腺样囊性癌的复发率,我们需要寻找新的富有疗效的化疗药。表柔比星是一种化疗药,已经被广泛用于膀胱癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤的治疗,疗效显著,但是其对涎腺腺样囊性癌的作用尚不清楚。小檗碱是一种在我国应用很久的中药,起初被用于解热镇痛,抗菌及胃肠道疾病的治疗,近年来,科研工作者们发现其还具有抗肿瘤的作用,但目前尚无小檗碱对涎腺腺样囊性癌作用的研究。因此,我们的实验评估了表柔比星和小檗碱对涎腺腺样囊性癌ACC2细胞系增殖,凋亡和自噬的影响。目的:1.评估表柔比星和小檗碱对腺样囊性癌ACC2细胞系增殖、凋亡和自噬的影响。2.研究表柔比星诱导ACC2细胞凋亡的机制。3.评估自噬与细胞耐药性的关系。方法:1.首先,利用CCK8试剂盒检测小檗碱(0μg/ml,3.5μg/ml,7.0μg/ml,14μg/ml)和表柔比星(0μg/ml,0.5μg/ml,1.0μg/ml,2.0μg/ml)在不同浓度下对涎腺腺样囊性癌ACC2细胞系增殖活性的影响。其次,检测小檗碱(7.0μg/ml)和表柔比星(1.0μg/ml)在不同作用时间下(24 h,48 h,and 72 h)对ACC2细胞增殖活性的影响。2.分别用小檗碱(7.0μg/ml)和表柔比星(1.0μg/ml)处理ACC2细胞后,用Annexin V-FITC/PI对细胞进行染色,后进行流式分析,评估细胞凋亡的情况。3.应用western blot实验检测小檗碱(7.0μg/ml)和表柔比星(1.0μg/ml)处理后ACC2细胞中LC3和P62的蛋白表达量,同时应用免疫荧光技术检测自噬小点的数量,研究表柔比星和小檗碱对ACC2细胞自噬的影响。4.应用western blot实验和免疫荧光技术检测表柔比星(1.0μg/ml)处理后细胞Bax、Bcl-2、细胞色素C蛋白表达量,研究表柔比星诱导细胞凋亡的机制。应用实时荧光定量PCR技术,检测表柔比星(1.0μg/ml)处理后Bax和Bcl-2信使RNA的表达量,进一步研究药物诱导细胞凋亡的机制。5.在表柔比星处理的细胞中加入自噬抑制剂氯喹,抑制自噬。再运用CCK8实验和Annexin V/PI染色法评估自噬对药物诱导凋亡的影响。结果:1.相同作用时间下,随着表柔比星和小檗碱浓度的升高,细胞活性逐渐降低。相同浓度下,表柔比星和小檗碱作用时间越长,细胞活性越低。2.小檗碱浓度在7.0μg/ml,作用24h时,约14.2%的细胞出现凋亡,表柔比星浓度在1.0μg/ml,作用24h时,约10.4%的细胞出现凋亡。3.western blot实验中,表柔比星处理的细胞中LC3II蛋白表达量增加,LC3I表达量变化不明显,P62蛋白表达量减少。而小檗碱处理的细胞中LC3I、LC3II和P62的蛋白表达量均无明显变化。免疫荧光实验中,表柔比星处理的细胞中自噬小点明显增加。4.western blot实验和免疫荧光技术均显示细胞Bax和细胞色素C的蛋白表达量明显增高,而Bcl-2蛋白表达量变化不显著。实时荧光定量PCR显示Bax的mRNA相对表达量明显增高,而Bcl-2的表达量变化无统计学意义。5.CCK8实验显示:表柔比星和氯喹联合用药组细胞活性明显低于表柔比星单独用药组。Annexin V/PI染色法显示:表柔比星和氯喹联合用药组细胞凋亡比例显著高于表柔比星单独用药组。结论:1.表柔比星和小檗碱可以降低ACC2细胞增殖活性,呈剂量和时间依赖性。表柔比星对细胞的作用强于小檗碱。2.表柔比星和小檗碱均可以诱导ACC2细胞凋亡。3.表柔比星可以诱导ACC2细胞发生自噬。小檗碱对自噬无明显影响。4.表柔比星通过提高Bax的表达,促进细胞色素C的释放,最终诱导ACC2细胞凋亡。5.自噬增加了ACC2细胞对表柔比星的耐药性。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.8
【图文】：

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图 3.1 表柔比星（EPI）和小檗碱（BER）对 ACC2 细胞的作用呈剂量和时间依赖性A：表柔比星处理 ACC2 细胞 24h 后，用 CCK8 试验检测细胞活性，表柔比星浓度分别为：0 μg/ml, 0.5 μg/ml, 1.0 μg/ml, 2.0 μg/ml B：小檗碱处理处理 ACC2细胞 24h后，用 CCK8 试验检测细胞活性，小檗碱浓度分别为：0 μg/ml, 3.5 μg/ml,7.0μg/ml, 14 μg/ml C：分别用固定浓度的表柔比星（1.0 μg/ml）和小檗碱（7.0μg/ml）处理 ACC2 细胞 24h，48h，72h后，CCK8 试验检测其活性3.3 表柔比星能诱导细胞自噬LC3 蛋白和 P62 蛋白与细胞自噬密切相关，它们的表达量能够反映细胞自噬的强弱。LC3 合成后，最初是以 LC3 前体的形式存在[3]，

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12 3.2 表柔比星（EPI）和小檗碱（BER）对 ACC2 细胞凋亡及自噬的作用表柔比星（1.0 μg/ml）、小檗碱（7.0μg/ml）或 DMSO（对照）处理 ACC2 细24h 后，收集细胞，Annexin V-FITC/PI 染色，流式细胞仪检测细胞凋亡情况表柔比星（1.0 μg/ml）或 DMSO 处理 ACC2 细胞 24h 后行 western blot 试验蛋白表达 C：表柔比星（1.0 μg/ml）或 DMSO 处理 ACC2 细胞 24h后，荧光试验检测自噬小点数量，照片由高内涵成像系统拍摄并进行数据处理。比星处理组中可见大量自噬小点。D：表柔比星处理组自噬阳性细胞比例显于对照组。(*P＜0.05)

【参考文献】