抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的制备及应用

发布时间：2020-06-29 09:54

【摘要】：分化型甲状腺癌(differentiated thyroid carcinoma,DTC)占全部甲状腺癌的90%以上,又可以分类为滤泡状甲状腺癌和乳头状甲状腺癌。近年来,分化型甲状腺癌的发病率呈逐年上升趋势。DTC患者的肿瘤复发率高达15%～30%。甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)是由甲状腺滤泡细胞合成分泌的660 kDa的大分子糖蛋白,是合成甲状腺激素的基质。分化良好的DTC细胞可合成和分泌Tg。当DTC患者接受甲状腺切除术及131碘治疗以后,血清Tg唯一的合理来源为DTC细胞活动释放。血清Tg可作为DTC特异性肿瘤标志物,应用于DTC患者术后的长期随访监测及预后判断。为了建立检测人血清甲状腺球蛋白的双抗体夹心 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法,我们首先选择天然人源Tg蛋白免疫BALB/c小鼠,进行三次免疫后取小鼠血清,利用间接ELISA检测抗体效价。选择效价最高的小鼠进行冲击免疫,4 d后进行细胞融合。通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞并亚克隆,最终获得了7株能稳定、高效分泌抗Tg蛋白单克隆抗体的细胞株,分别命名为1B5、5E1、5F11、5F12、6E5、9E3、12H8。利用杂交瘤细胞通过体内诱生腹水法制备小鼠的腹水,并对腹水效价进行了检测。结果显示1B5抗体效价大于1:6 400,其余6株抗体效价可达1:25 600。然后利用硫酸铵沉淀和蛋白质G亲和层析法对腹水中的抗体进行了纯化。利用间接ELISA法对单克隆抗体的亚型进行分析。结果显示,除9E3为IgG2a外,其他6株抗体均为IgG1。利用所制备的单克隆抗体建立了检测Tg的双抗体夹心ELISA方法,并对检测方法进行了条件优化。建立的双抗体夹心ELISA方法敏感性可达1ng/mL。用构建的体系与临床用商品化的试剂盒检测结果进行比较,结果表明临床样本检测值与医院临床值相关性较好。本课题的开展,为今后开发拥有自主知识产权的甲状腺球蛋白诊断试剂盒奠定了基础。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.51
【图文】：

小鼠血清,免疫后,小鼠

通过间接ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠血清抗体效价，阴性对照为未免疫小鼠血逡逑清。设定大于阴性值的２．１倍为阳性值。小鼠在初次免疫后体内抗体效价较低，逡逑在第二次和第三次免疫后可以发现血清阳性值０Ｄ值明显上升（图３－１），说明逡逑Ｔｇ能在小鼠体内引起一定的免疫反应，作为抗原具有良好的免疫原性。在第三逡逑次免疫后第１４邋ｄ，检测小鼠血清中抗体效价，结果如表３－１所示，４只小鼠效价逡逑均达１邋：邋４００邋０００以上，达到细胞融合要求，可对小鼠进行冲击免疫后进行细胞融逡逑合。逡逑１邋５－｜逡逑■Ｉ实验组小鼠逡逑Ｉ逦W柋对照逡逑Ｃ邋｜逡逑免疫次数逡逑图３－１小鼠血清四十万倍稀释后抗体效价逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｔｉｔｅｒｓ邋ｏｆ邋ｓｅｒｕｍ邋ｉｎ邋ｍｉｃｅ邋ａｆｔｅｒ邋ｄｉｌｕｔｅｄ邋ｆｏｕｒ邋ｈｕｎｄｒｅｄ邋ｔｈｏｕｓａｎｄ逡逑２２逡逑

标准曲线,效价,单克隆抗体,试剂盒

３．４纯化后的单克隆抗体蛋白浓度逡逑用ＢＣＡ试剂盒测定纯化的单克隆抗体浓度，通过标准品ＢＳＡ绘制标准曲线，逡逑获得标准曲线公式为ｙ邋＝邋０．９４２５邋ｘ－０．０６７６，邋Ｒ２邋＝邋０．９９５２邋（表３－３、图３－３），根据抗逡逑２４逡逑

【参考文献】