钙通道蛋白TRPV1对黑素瘤生长的作用及机制研究

发布时间：2020-06-30 18:50

【摘要】：背景:黑素瘤是源于黑素细胞的皮肤恶性肿瘤,具有发展迅速、预后差等特点,远处脏器转移患者的五年生存率低于20%。在近年的研究中,MAPK等关键信号通路、BRAF等药物靶点的发现及免疫治疗的进展,大大的提高的黑素瘤患者的预后。然而,由于黑素瘤在遗传及表观遗传特征、信号转导通路活化及生物学行为等不同层面均具有较强的异质性,使得上述治疗仍在相当数量的患者中无效或者产生耐药。因此,进一步阐明黑素瘤发病分子机制,对提高黑素瘤的治疗效果和改善患者预后均具有重要意义。Ca~(2+)作为第二信使参与细胞多种生理病理活动,包括细胞信号转导、肿瘤发生发展等。近年来大量研究表明,阻断黑素瘤细胞的T型Ca~(2+)通道会诱导细胞凋亡;Ca~(2+)依赖信号活化可通过增加actin组装促进黑素瘤细胞迁移,表明Ca~(2+)在黑素瘤增殖和侵袭中发挥重要作用。Ca~(2+)信号转导依赖于Ca~(2+)通道,Ca~(2+)通道蛋白对Ca~(2+)信号转导具有关键的调节作用,因此Ca~(2+)通道蛋白对黑素瘤发生发展具有重要调控作用。瞬时受体电位蛋白(Transient receptor potential,TRP)家族是存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的一类超家族离子通道蛋白,是细胞Ca~(2+)离子转运的重要通道。瞬时感受器电位香草酸受体1(Transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)是目前最受关注的TRP家族成员之一,又名辣椒素受体,可特异性被capsaicin辣椒素、伤害性热刺激、酸及多种内源性配体等激活,在调节代谢、衰老、肿瘤生长和抑制炎症等过程中发挥重要作用。既往研究表明,敲除TRPV1基因可通过增加EGFR通路促进APC~(Min/+)小鼠肠癌发展,发挥抑癌作用;此外,TRPV1缺失可抑制前列腺癌细胞增殖,使结直肠癌细胞对压力诱导的细胞凋亡更敏感,说明TRPV1在不同肿瘤中可发挥促癌或抑癌的不同作用。最新研究发现,TRPV1在角质形成细胞和黑素细胞中均有表达,对维持皮肤稳态具有重要作用。如前所述,Ca~(2+)在黑素瘤的发生发展中起到重要作用,而TRPV1作为重要的非选择性Ca~(2+)通道蛋白,其是否通过Ca~(2+)依赖方式影响黑素瘤生长、迁移及其机制目前尚不明确。我们前期研究发现,TRPV1在黑素瘤组织和细胞系中显著低表达;过表达TRPV1或capsaicin激活TRPV1可通过激活p53显著抑制黑素瘤细胞增殖同时诱导其凋亡,提示TRPV1在黑素瘤中可能通过p53发挥抑癌作用。基于此,我们提出以下假说:黑素瘤中TRPV1激活,介导Ca~(2+)内流,通过Ca~(2+)相关分子,诱导p53活化,从而抑制黑素瘤生长。目的:1.检测黑素瘤中TRPV1的表达,明确TRPV1表达水平与患者预后的相关性;2.明确黑素瘤中TRPV1对细胞生长的调控作用及其功能;3.阐明TRPV1调控黑素瘤细胞生长的分子机制;4.利用动物模型明确TRPV1在黑素瘤生长中的作用。方法:1.利用qRT-PCR、Western blot及免疫组化技术从细胞系、组织水平对TRPV1mRNA、蛋白水平及定位进行检测;对TRPV1表达水平及黑素瘤患者预后进行相关性分析;2.过表达/capsaicin药物激活TRPV1,同时干涉抑癌基因p53,应用CCK8、克隆形成检测TRPV1调控p53对黑素瘤细胞生长活性的影响;利用流式细胞术检测其调控p53对细胞凋亡的影响;利用western blot、qRT-PCR检测TRPV1调控p53对黑素瘤细胞凋亡相关基因表达的影响;3.过表达/capsaicin药物激活TRPV1,采用Fluo-4 AM探针检测Ca~(2+)内流情况;利用western blot检测Ca~(2+)相关蛋白的表达;4.过表达/capsaicin药物激活TRPV1,联合应用钙蛋白酶calpain抑制剂ALLM、钙调磷酸酶calcineurin抑制剂FK506、钙/钙调素依赖性蛋白激酶II CaMKII抑制剂KN-93,应用CCK8和克隆形成检测TRPV1调控Ca~(2+)依赖蛋白对黑素瘤细胞生长活性的影响;过表达/capsaicin药物激活TRPV1,联合应用钙调磷酸酶抑制剂FK506,利用流式细胞术、western blot、ChIP、qRT-PCR技术检测TRPV1调控钙调磷酸酶对黑素瘤细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响;5.过表达/capsaicin药物激活TRPV1,联合过表达p53负转录因子ATF3,应用CCK8、克隆形成检测TRPV1调控转录因子ATF3对黑素瘤细胞生长活性的影响;利用流式细胞术、western blot、ChIP、qRT-PCR技术检测TRPV1调控转录因子ATF3对黑素瘤细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响;6.过表达/capsaicin药物激活TRPV1,利用裸鼠荷瘤模型检测TRPV1对黑素瘤细胞生长的影响;利用免疫组化技术检测成瘤体内TRPV1对细胞增殖、NFAT2-ATF3-p53信号通路的影响。结果:1.与色素痣组织及原代黑素细胞相比,黑素瘤组织及黑素瘤细胞系中TRPV1表达水平均降低,同时黑素瘤组织中TRPV1表达与黑素瘤患者生存期呈显著正相关;选取TRPV1低表达A2058、A375两株细胞系为研究对象进行后续实验;2.CCK8和克隆形成结果显示:过表达/capsaicin药物激活TRPV1可抑制黑素瘤细胞增殖,联合应用p53干涉片段后,可部分回复对细胞增殖的抑制;细胞凋亡结果显示:过表达/capsaicin药物激活TRPV1可诱导黑素瘤细胞凋亡,联合应用p53干涉片段后,可部分回复对凋亡的促进作用;Western blot、ChIP及RT-PCR结果显示:过表达/capsaicin药物激活TRPV1可诱导黑素瘤细胞凋亡相关分子的蛋白和mRNA表达及上述分子与p53启动子区结合能力,联合应用p53干涉片段后,可部分回复对促凋亡蛋白的表达及与p53启动子区的结合能力;3.Fluo-4 AM探针检测Ca~(2+)内流结果显示:过表达/capsaicin药物激活TRPV1可显著增加细胞Ca~(2+)内流;Western blot结果显示:过表达/capsaicin药物激活TRPV1可降低细胞p-NFAT2表达;4.CCK8和克隆形成结果显示:过表达/capsaicin药物激活TRPV1联合应用钙蛋白酶抑制剂ALLM和钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制剂KN-93,不能回复过表达/capsaicin药物激活TRPV1对细胞增殖的抑制,联合应用钙调磷酸酶抑制剂FK506可回复过表达/capsaicin药物激活TRPV1对生长活性的抑制;细胞凋亡结果显示:联合应用钙调磷酸酶抑制剂FK506,可部分回复过表达/capsaicin药物激活TRPV1对凋亡的促进作用;Western blot、ChIP及RT-PCR结果显示:应用钙调磷酸酶抑制剂FK506,可部分回复过表达/capsaicin药物激活TRPV1诱导促凋亡蛋白的表达水平及与p53启动子区的结合能力,可部分回复过表达/capsaicin药物激活TRPV1抑制的转录因子ATF3的表达水平;5.CCK8和克隆形成结果显示:联合过表达ATF3后可部分回复过表达/capsaicin药物激活TRPV1对生长活性的抑制;细胞凋亡结果显示:联合过表达ATF3,可部分回复过表达/capsaicin药物激活TRPV1对凋亡的促进作用;Western blot、ChIP及RT-PCR结果显示:联合过表达ATF3可部分回复过表达/capsaicin药物激活TRPV1诱导促凋亡蛋白的表达水平;6.裸鼠荷瘤实验显示:过表达/capsaicin药物激活TRPV1可减少黑素瘤瘤体的重量及体积;免疫荧光结果显示:过表达/capsaicin药物激活TRPV1可抑制黑素瘤瘤体Ki-67表达水平。组织病理学检查结果显示:过表达/capsaicin药物激活TRPV1可抑制ATF3信号,上调p53表达。结论:通过本课题的研究,我们首次发现黑素瘤细胞中TRPV1低表达,且和患者预后不良显著相关。激活TRPV1可通过calcineurin-NFAT2-ATF3-p53信号通路抑制黑素瘤生长。我们的发现加深了TRPV1对黑素瘤生长调控的认识,并为黑素瘤的临床诊疗提供新的思路及治疗靶点,对黑素瘤临床选择用药具有重要意义。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.5
【图文】：

黑素瘤,MAPK通路,发生发展,分子

活化蛋白激酶（MAPK）通路，又被称为 RAS/RAF/MEK/ER中，MAPK 受到胞外刺激信号激活进行一系列信号转导，从育、增殖和分化。在黑素瘤发生发展过程中该通路持续激活，分裂、增殖[29]。首先，MAPK 被与酪氨酸激酶受体（RTKs）细胞因子、激素、神经递质、生长因子等）刺激，激活癌基因DP 转换为 RAS GTP 从而提高 RAS-GTP 水平，进一步激活下RAF-1、ARAF、BRAF），RAF 激酶限制底物特异性并激活特EK2，活化相关蛋白激酶，促进转录因子转录，引发生物学效瘤中被异常激活[31]，磷酸化 Ets、c-Jun、c-Myc、P90Rak-CRE、Bad、Caspase-9 等多种凋亡效应因子，启动上多种生长因子调细胞周期蛋白 cyclinD1 和侵袭相关基因 MMPs 的表达，刺、肿瘤血管生成、促进黑素瘤细胞周期进展，增加细胞抗凋亡

黑素瘤,发生发展,分子,去磷酸化

空军军医大学博士学位论文子 1）受体结合被 IGF-1 激活，催化 PIP2（磷脂酰肌醇(4,5)二醇(3,4,5)三磷酸），进一步活化 PDK1（丙酮酸脱氢酶激酶 1KT（丝氨酸-苏氨酸特异性激酶），最终靶向磷酸化多种蛋白 GSK3β，导致 β-catenin 积累并发生核转位，上调 c-MYC 和表达[36]；此外，p-AKT 磷酸化 ERK，通过活化 mTOR 分子而诱导黑素瘤细胞的抗凋亡作用，促进其异常增殖[37]。黑素瘤中发现 PI3K 信号通路抑制分子 PTEN 缺失或失活[38]质磷酸酶活性，抑制 PIP3去磷酸化，上调 p-AKT 水平，增TEN 靶向去磷酸化粘着斑激酶（FAK），失活后抑制其对细胞控[40]；PTEN 通过对受体蛋白去磷酸化参与 MAPK 信号通路EK1/2 和 ERK1/2 磷酸化水平，促进黑素瘤增殖[41]。

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