circBIRC6竞争性吸附miR-488调控GRIN2D影响自噬介导胃癌恶性表型的机制研究

发布时间：2020-07-06 15:14

【摘要】：目的:1.探讨circBIRC6在胃癌组织中的表达及对胃癌细胞功能的影响;2.揭示circBIRC6通过竞争性吸附miR-488进而激活GRIN2D基因在胃癌恶性表型中的作用机制;3.探讨circBIRC6-miR-488-GRIN2D轴对胃癌自噬的影响;4.研究GRIN2D在胃癌中的表达及生物学功能,并分析其与胃癌临床特征及预后的关系。方法:1.通过Hiseq平台的第二代测序对6例胃癌新鲜样本(设对照组)的基因全转录组进行高通量分析,寻找胃癌差异表达的基因;2.用30例胃癌组织(设对照组),经实时荧光定量PCR检测circBIRC6的表达水平;3.构建circBIRC6过表达载体及干扰质粒在细胞水平验证circBIRC6在胃癌中的作用;4.生物信息学筛选circBIR6下游miRNA,用荧光原位杂交的方法检测circBIRC6与候选miRNA在胃癌细胞中的定位情况;5.通过实时荧光定量PCR方法和RNA免疫共沉淀方法在胃癌细胞系中检测circBIRC6对miR-488的影响;6.通过生物信息学分析miR-488的靶基因,并通过免疫印迹检测其对靶基因蛋白水平的影响;7.通过双荧光素酶报告实验验证miR-488与GRIN2D的结合位点;8.免疫组织化学法检测胃癌组织及对照组织中GRIN2D的表达,统计分析其与临床特征的相关性,并结合随访数据评估其预后价值;9.用过表达和crispr/cas9敲除技术在体外水平研究GRIN2D对GC发展的影响;10.挽救实验验证circBIRC6与miR-488及GRIN2D三者之间的调控关系以及对自噬的影响。结果:1.6对样本二代测序结果显示胃癌中差异mRNA共637个,其中269个为上调的mRNA,368个为下调mRNA;差异的miRNA共37个,23个为上调miRNA,14个为下调miRNA;差异circRNA共125个,57个为上调circRNA,68个为下调circRNA;2.circBIRC6在胃癌组织中表达高于配对良性切缘组织,(P0.001);3.胃癌细胞过表达circBIRC6后,胃癌细胞的增殖能力和侵袭迁移能力明显增强;干扰circBIRC6后,胃癌细胞增殖能力和侵袭迁移能力明显下降,凋亡增加;4.经生物信息学分析,miR-488是circBIRC6的靶基因,通过荧光原位杂交实验证实二者在细胞浆中存在共定位,RNA免疫共沉淀结果显示circBIRC6、miR-488和AGO2可以形成三元复合物;5.过表达circBIRC6可以抑制miR-488的表达,反之,抑制circBIRC6后miR-488表达升高;6.生物信息学分析结果显示GRIN2D的3’非翻译区包含潜在的miR-488结合位点。荧光素酶报告载体实验证实miR-488能够通过作用于GRIN2D基因的3’非翻译区对其表达进行负性调节;7.免疫印迹结果表明miR-488能够抑制GRIN2D的表达;8.挽救实验证实miR-488通过下调GRIN2D在胃癌中发挥抑癌作用;9.用免疫组化法检测胃癌组织中GRIN2D蛋白的表达情况,并分析GRIN2D的表达与胃癌临床特征、预后的关系。结果:卡方分析结果显示,胃癌组织中GRIN2D表达高于良性组织(χ~2=54.058,P0.001)。GRIN2D在胃癌组织中高表达与TNM分期晚有关,并具有明显统计学意义(χ~2=24.496,P=0.002)。多因素生存分析结果显示GRIN2D(P0.001,HR=2.383,95%CI为1.627-3.49),TNM分期(P0.001,HR=1.502,95%CI为1.366-1.652)和手术前CEA(P=0.017,HR=1.682,95%CI为1.098-2.574)是胃癌患者预后的独立因素;10.在胃癌细胞中,过表达GRIN2D后,胃癌细胞的增殖能力和侵袭迁移能力明显增强;敲除GRIN2D后,胃癌细胞的增殖能力和侵袭迁移能力明显下降;11.过表达circBIRC6后,自噬相关蛋白Beclin-1蛋白和LC3蛋白B表达下调,P62蛋白表达上调。在挽救实验中,过表达miR-488则能抑制circBIRC6对胃癌细胞的作用,但该抑制作用在过表达GRIN2D后被抵消。结论:1.circBIRC6竞争性结合miR-488,解除miR488对GRIN2D的抑制作用,从而促进GRIN2D的表达;2.circBIRC6-miR-488-GRIN2D轴通过影响自噬介导胃癌的恶性表型;3.GRIN2D在胃癌中高表达与TNM分期晚有关,是胃癌患者预后的独立因素,体外功能学实验显示GRIN2D可介导胃癌的恶性表型。
【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

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